细胞膜上G蛋白偶联受体聚集与分布的荧光闪烁碳点超分辨成像

Quantifying G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) clustering and distribution on cell membrane at the nanoscale is of great significance for the in-depth understanding of their physiological and pathological roles. The recent advent of super-resolution fluorescence microscopy has opened up the possibility of imaging GPCR clustering and distribution at a resolution down to several nanometers beyond the optical diffraction limit. Owing to the poor photo-stability of organic dyes and exogenous fluorescent proteins, however, the existing super-resolution imaging methods remain challenging to probe and quantify GPCRs on cell membrane under physiological and pathological conditions. In this project, using photo-stable, ultra-small sized and fluorescent blinking carbon dots (CDs), we aim to develop single-particle localization-based super-resolution microscopy, and then study the clustering and distribution of GPCRs such as chemokine receptor CXCR4 on cell membrane at the nanoscale and their links to signal transduction and internalization. This project will thus provide some new insights into the physiological and pathological importance of GPCR clustering and distribution for drug design and disease therapies. The research contents include 1) Synthesis, characterization and biological functionalization of fluorescent blinking CDs; 2) Establishing blinking CD-based super-resolution fluorescence microscopy technique; and 3) Super-resolution imaging and quantitative analysis of CXCR4 clustering and distribution on cell membrane.

在纳米尺度上研究细胞膜表面G蛋白偶联受体（GPCR）的聚集和分布，对于深入理解GPCR的生理病理学行为具有重要作用。超分辨荧光显微镜能够突破光学衍射的限制，将分辨率提高到几十甚至几纳米，可用于GPCR聚集和分布的研究。然而，现有超分辨荧光成像方法使用基因表达的荧光蛋白和光学稳定性欠佳的有机染料作为标记物，研究生命体系GPCR时受到诸多限制。本项目拟利用光学稳定性好、超小、荧光闪烁的碳点，建立基于单颗粒定位的超分辨荧光成像技术，用于细胞膜上趋化因子受体CXCR4等GPCR多聚体和聚簇及其分布的研究，揭示GPCR聚集体与其细胞信号转导和内化的关系，深入理解GPCR及其聚集体的生理病理学行为，为治疗相关疾病和开展药物设计提供研究思路。主要研究内容：（1）荧光闪烁碳点的合成、表征和生物功能化；（2）建立基于荧光闪烁碳点的超分辨成像技术；（3）细胞膜上CXCR4等GPCR聚集和分布的超分辨成像。

在纳米尺度上研究细胞膜表面G蛋白偶联受体（GPCR）的聚集和分布，对于深入理解GPCR的生理病理学行为具有重要作用。本项目率先提出和发展基于碳点闪烁的单分子超分辨成像新方法，用于细胞膜上趋化因子受体CXCR4等GPCR多聚体和聚簇及其分布的研究，并取得了预期的成果。在本项目中，我们围绕荧光碳点、单分子超分辨成像方法学、细胞膜受体单分子荧光成像开展研究。1）通过研究不同结构碳点的闪烁行为，深入研究碳点的闪烁机理，实现对荧光闪烁碳点的理性合成和调控；2）基于碳点的荧光闪烁特征，发展了单分子定量超分辨成像新方法，定位精度达10 nm，衍射斑内分子计数的准确度 > 97%；3）设计和合成了近红外荧光闪烁碳点（发射峰波长750 nm），使成像信噪比提高52%，可用于细胞内受体的单分子定量超分辨成像；4）基于碳点的闪烁指纹特征，设计并训练了可自动识别细胞膜上单体和聚集体的深度学习模型，进一步提高了单分子定量超分辨成像的可靠性；5）使用基于碳点闪烁的单分子超分辨成像新方法，揭示了细胞膜上CXCR4的聚集、分布及其配体（激动剂、拮抗剂、反向激动剂）的调控机理；揭示了脂筏、细胞骨架等细胞膜结构对CXCR4聚集的影响；6）揭示了异源表达和天然表达CXCR4在细胞膜上聚集和分布的差异；7）阐释了细胞膜上CXCR4单体、聚集体及其与内化过程的关系。本项目在分析化学方法学方面极大促进了超分辨荧光成像技术的发展，为生物体系等复杂体系研究提供了新的分析表征手段；在生物学应用方面也促进了对GPCR聚集现象的深入理解和相关高效特异性药物的研究。项目研究发表标注该基金的论文总共15篇。其中，项目负责人以第一作者或（共同）通讯作者发表第一标注的论文11篇，包括Analytical Chemistry 4篇、Nano Letters 4篇、ACS Sensors 1篇、Chemical Communications 1篇、ACS Applied Materials & Interfaces 1篇；申请国家发明专利2项；培养博士和硕士研究生14名（9名毕业和5名在读）。