IFITM3调节结肠癌免疫逃逸的作用机制研究

Tumour cells escape from immune survillence through inducing immune tolerence.Regulatory T cells (Treg) play a pivotal role in mediating immune tolerence.Previously, we identified IFITM3 as a new diagnostic and functional marker of colon cancer;The expression of IFITM3 in colon cancer cells promoted migration of Treg cells in vitro and infiltration in vivo;In vitro, IFITM3 selectively upregulated CXCL14 expression in colon cancer cells through NF-kb signaling pathway and promoted migration of Treg cells.Therefore,we hypothesize that IFITM3 promotes migration of Treg cells through inducing colon cancer cells to produce CXCL14 and thus inhibits function of CD8+ cytotoxic T cells (CTL) and promotes escape from immune responses.We will first investigate the relationship of IFITM3 expression and infitration of Treg and CD8+ CTL cells by using human colon cancer tissue assay and mice model of colon cancer; Then we will elucidate the role of CXCL14 in IFITM3-mediated chemotaxis of Treg cells by antibody blocking assay both in vitro and in vivo;Lastly,we will identify the role and underlying mechanism of NF-kb pathway in IFITM3-mediated upregulation of CXCL14 expression by using site mutation and chromatin immunoprecipitation assay.We aim to elucidate the role and underlying mechanisms of IFITM3 in tumour immune regulation and provide a new target for clinical immunotherapeutic treatment in the further.

肿瘤细胞通过诱导免疫耐受逃避机体免疫监视,调节性T细胞（Treg）是介导免疫耐受的重要细胞类型。课题组前期发现干扰素跨膜蛋白IFITM3是新的结肠癌肿瘤标志物,高表达IFITM3的结肠癌细胞促进Treg体外趋化和体内浸润；体外IFITM3通过NF-kb通路特异性上调结肠癌细胞表达CXCL14，促进Treg迁移。由此推测IFITM3通过诱导结肠癌细胞分泌CXCL14，趋化Treg浸润以抑制CD8+杀伤T细胞功能，介导结肠癌细胞免疫逃逸。本项目拟利用人结肠癌组织芯片和小鼠结肠癌模型阐明IFITM3表达与Treg和CD8+CTL浸润相关性；利用体内外抗体中和揭示IFITM3通过上调CXCL14表达促进Treg浸润的机制；利用点突变、染色质免疫沉淀等明确IFITM3通过调控NF-kb信号通路上调CXCL14表达的分子机制。旨在阐明IFITM3介导结肠癌免疫耐受的作用机制，为临床免疫治疗提供新靶点。

结直肠癌是全球第三大高发肿瘤，致死率高居第四位。除错配修复基因以外，目前仍无有效的诊断性肿瘤标志物，主要原因还是由于人们对肿瘤发生发展机制缺乏透彻认识。本课题通过探索肿瘤微环境中肿瘤细胞与调节性T细胞的相互作用，在体外transwell实验揭示结肠癌特异性肿瘤标志物IFITM3介导肿瘤细胞促进调节性T细胞迁移；体内成瘤实验揭示肿瘤细胞高表达IFITM3与肿瘤组织中调节性T细胞浸润正相关，与CD8+杀伤T细胞浸润负相关。在体外高表达IFITM3能够显著上调CXCL14蛋白表达水平，进而促进调节性T细胞向肿瘤细胞的迁移；在体外中和CXCL14能够显著抑制过表达IFITM3结肠癌细胞系对调节性T细胞的招募能力。然而，在体内条件下，利用特异性抗体清除调节性T细胞并不能显著阻断IFITM3对肿瘤发生的促进作用；中和CXCL14未对IFITM3高表达细胞系形成的肿瘤组织中调节性T细胞浸润造成影响。因此，我们认为IFITM3能够在体外介导调节性T细胞迁移，但是在体内复杂病理环境中，IFITM3对肿瘤发生的促进作用并非主要依赖于对调节性T细胞的浸润的调控，而是依赖于IFITM3对肿瘤细胞自身的调控。尽管如此，对于肿瘤细胞和免疫细胞相互作用机制的研究仍然对于我们深入了解肿瘤免疫逃逸机制和找到潜在的治疗靶点具有重要的意义。另外，由于前期研究结果发现IFITM3可以通过NF-kb信号通路上调CXCL14，且NF-kb典型通路的激活对于结肠癌二期患者具有重要临床诊断意义，因此我们通过对NF-kb上游调控分子的探索，找到了更为关键的调控NF-kb信号通路的新型肿瘤标志物DDA1。我们发现DDA1在肿瘤组织中mRNA和蛋白水平显著高于周围正常组织；沉默DDA1或者过表达DDA1能够显著抑制或促进小鼠体内肿瘤组织的形成。过表达或沉默DDA1结直肠癌细胞系HT29和SW580中NF-kb的核定位相应增加或减少。免疫印迹检测p-Ikb、p-IKK、CSN2和p-GSK3b等NF-kb信号通路组分在过表达DDA1细胞中显著增加，证明结直肠癌肿瘤中DDA1激活NF-kb/CNS2/GSK3b的信号通路促进结直肠肿瘤发生发展。这部分研究内容已作为研究论文的一部分数据已在国际肿瘤期刊《oncotarget》上发表（影响因子：5.0,2016,12;7(15):19794-812）。