嗜热细菌铜锌超氧化物歧化酶/2-酮异戊酸脱氢酶互作特征的研究

采用免疫共沉淀、细菌双杂交和基因定向突变等技术验证并确定嗜热细菌铜锌超氧化物歧化酶（SOD）与 2-酮异戊酸脱氢酶的细胞内互作机制，从而获得相互作用的特异基因片段和作用位点。在大肠杆菌中高效表达，分离纯化两种酶和特异基因片断的表达产物，得到它们的高纯度产品，研究相关理化酶学特性、结合特性和调节行为。设计溶液体系的催化反应，研究互作特性及其反应机理，寻找SOD介导氨基酸生物代谢的证据。本项目拟进一步展开嗜热细菌铜锌超氧化物歧化酶和2-酮异戊酸脱氢酶及其复合蛋白的研究，不仅可以进一步认识嗜热细菌表达的耐热酶的耐热机理及其作用，有利于从嗜热微生物获得有重要应用价值的分子生物学高温工具酶和工业用高温酶。更大的意义在于由两种酶的互作机制可能发现SOD介导氨基酸生物代谢的基本过程的新功能，进一步认识生命过程的本质。

人们已从嗜热菌中分离纯化得到多种嗜热酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、磷酸酶、脱氢酶等。早在1997年Lim等报道了Aquifex pyrophilus中铁超氧化物岐化酶，并在三维结构上研究了其耐热机制，但至今有关嗜热菌中超氧化物岐化酶的报道极少。对嗜热酶的耐热机制研究表明嗜热酶通常对酸、碱、有机溶剂等有较好的抗性,特别是热稳定性好。嗜热酶的稳定机制与结构密切相关,一级结构中疏水、带电荷及芳香族氨基酸相对较多,二级结构中α螺旋结构更加稳定,从高级结构看,嗜热酶含有大量的盐桥、氢键、离子对等与稳定性相关的因素。然而，尽管人们已从不同的角度和不同的性质研究了嗜热酶的耐热机制，但有关蛋白质互作与其热稳定性的研究未见报道。本项目从50株嗜热菌中筛选Thermus thermophilus WL为材料，通过蛋白质组学研究发现共有17种蛋白在高温下上调表达。从17个基因中选择超氧化物岐化酶进行基因功能研究，发现与嗜热菌的热适应性相关。为了了解高温下表达的17种蛋白通过何种途径参与热适应性，进一步选用SOD进行蛋白质互作研究。采用免疫共沉淀技术，从T. thermophilus WL中获得与其结合的蛋白，经质谱鉴定为2-酮异戊酸脱氢酶亚基。2-酮异戊酸脱氢酶基因重组表达，纯化重组蛋白制备抗体，Western blot结果表明，与SOD结合的蛋白是2-酮异戊酸脱氢酶。利用细菌双杂交系统，将SOD和2-酮异戊酸脱氢酶相应的基因克隆在质粒中，随后共转化，通过选择性培养基进行筛选,结果同样显示SOD和2-酮异戊酸脱氢酶存在相互作用。进一步通过基因定向突变等技术验证并确定两种酶的细胞内互作机制，得到分子间整体相互作用的结论。在大肠杆菌中高效表达，分离纯化得到两种酶的高表达产物；研究了相关理化、酶学特性和结合反应特征，初步探索了SOD介导氨基酸生物代谢研究的实验方法。项目研究对进一步认识嗜热细菌表达的耐热酶的耐热机理及其作用具有重要启示。有利于从嗜热微生物获得有重要应用价值的分子生物学高温工具酶和工业用高温酶。