蛋白质和核酸靶向脑线粒体转运的研究及其在帕金森氏病模型中的作用

Mitochondria dysfunction plays a central role in neurological diseases, in particular, Parkinson's disease. Until now, there are no available methods to achieve the targeted-delivery molecules into brain mitochondria. Development of effective carriers may be indispensable for this problem. In this study, we fuse the rabies virus glycoprotein derived peptide (RDP) of brain-targeting ability and mitochondrial targeting sequences (MTS), construct the brain mitochondria targeting approaches, and examine the targeting ability of these approaches and their transport mechanism. Firstly, we will demonstrate that the RDP-MTS can deliver the green fluorescent protein and its gene into neuron mitochondria, and that RDP can cargo plasmid containing MTS nucleotide into neurons and proteins are located in mitochondria after gene expression, through in vitro (separated mitochondria, cultured nerve cells and blood-brain barrier model) and in vivo studies. Secondly, peptides and mitochondria NADH-ubiquinone internal oxidoreductase (Ndi1) are linked, and formed fusion protein or peptide-nucleic acid compounds, then we will identify that the peptides can carry protein and nucleic acid across blood-brain barrier into brain mitochondria, and exert therapeutic effects for Parkinson's disease model animals. Additionally, the transport mechanism of protein or peptide-nucleic acid will be investigated. The findings of this study will provide important information about using proteins and nucleic acids to regulation mitochondria functions for treating neurological diseases, and will supply the new knowledge essential for targeting delivery molecules into brain organelle in theoretical framework and technical support.

线粒体功能紊乱是多种神经疾病的关键环节。目前尚无合适的方法实现脑线粒体的靶向转运，开发有效载体是解决这个难题的必然途径。本项目将具有靶脑转运功能的狂犬病毒糖蛋白衍生肽(RDP)和线粒体靶向序列(MTS) 融合，构建靶向脑线粒体的运载方式，实验验证其运载功能及跨膜机制。首先，以分离的线粒体和培养的神经元等体外实验为基础，以动物体内实验为依据，证明RDP-MTS可携带绿色荧光蛋白及其核酸进入神经元线粒体、证明RDP可运载带有MTS基因的质粒在细胞表达后定位于线粒体；其次，将多肽与线粒体内NADH-泛醌氧化还原酶(Ndi1)连接，形成融合蛋白或多肽/核酸复合物，确证多肽能引导Ndi1蛋白或其基因进入脑线粒体，发挥治疗帕金森氏病模型动物的作用；另外，探讨多肽运载蛋白质和核酸的穿膜机制。本研究为使用蛋白质和核酸调节脑线粒体功能提供安全有效的方法，也为分子靶向脑细胞器转运提供重要的理论依据与技术支持。

线粒体功能失调在帕金森氏病等中枢神经系统疾病的发生发展中起着至关重要的作用。线粒体是细胞内能量生成的关键细胞器，为细胞提供能源，维持细胞的存活和正常功能。在帕金森氏病中，存在着线粒体电子传递链缺陷和（或）线粒体DNA损伤，最终导致细胞凋亡。为了治疗这类疾病和发展线粒体医学，必须使用合理方法，人为调控线粒体功能，保护线粒体以防止细胞受损。这就需要将具有生物活性的物质选择性地运载进线粒体。然而，目前尚无合适的方法实现化合物向脑内神经细胞线粒体转运。我们在以往的工作基础上，制备了具有靶向神经细胞功能和靶向线粒体运输这双重功能的多肽载体RDP-MTS，选择性地将EGFP蛋白及其核酸转运至体外培养的神经细胞和动物脑线粒体内，通过激光共聚焦显微镜观测、流式细胞仪、组织切片等技术，验证了RDP-MTS的靶向功能；随后我们使用了线粒体功能性蛋白Ndi1，进而证明了携带RDP-MTS可携带Ndi1蛋白及其核酸进入SH-SY5Y神经细胞，在细胞内发挥抗自由基、降低细胞凋亡等作用，并在线粒体功能障碍的帕金森氏病模型动物体内，通过转棒实验、爬杆实验、生化指标测定等验证了RDP-MTS复合物对帕金森氏病模型动物的治疗作用。同时，使用内吞抑制剂和受体拮抗剂的方法，验证了RDP-MTS通过受体依赖的内吞方式进入细胞。该项目对调控神经细胞线粒体的功能、揭示线粒体生命科学的本质、了解相关疾病的病理机制，以及寻找有效的干预途径等方面都具有重要意义。该项目的实施获得了重庆市自然科学奖一项、著作2部、申请专利一项、发表论文19篇、培养研究生11名。