角膜基质细胞Nrf2-ARE信号通路活化缺陷在圆锥角膜病变中的作用机制研究

Recent researches showed that oxidative stress and the high activity of matrix degenerating enzymes were involved in the progress of keratoconus. NF-E2-related factor 2-antioxidant response element (Nrf2-ARE) pathway plays a critical role in the defense against oxidative stress. In our previous research, the stromal cells of keratoconus showed higher nuclear Nrf2 level than normal cornea , while the expression levels of Nrf2-ARE downstream antioxidant genes in keratoconus were lower than normal cornea. This defect of Nrf2-ARE pathway was involved in the activity of matrix degenerating enzymes, while epigenetic drug targeting demethylation showed reversed effect in this defect of keratoconus. Based on this, we will do the further study listed as follow: （1） To verify the mechanism of Nrf2-ARE signal in keratoconus pathogenesis, we will use Nrf2-ARE signal activator or Nrf2-siRNA to pretreat the corneal stromal cells , and then we will test the expression of Nrf2-ARE downstream antioxidant genes and matrix degenerating enzymes. （2）We will use MeDIP-chip to screen methylated sites of Nrf2-ARE downstream antioxidant genes, and make functional verification with demethylase for these sites. Our purpose is to illuminate the mechanism of Nrf2-ARE signal defect in keratoconus pathogenesis, and to explore new theory for clinical therapy .

角膜基质细胞氧化应激和基质降解酶活性增强在圆锥角膜病变中具有重要作用，Nrf2-ARE信号通路是介导细胞抗氧化反应的关键通路。本课题组前期研究发现，虽然圆锥角膜基质细胞核内Nrf2蛋白水平高于正常细胞，但其下游抗氧化基因的表达量明显低于正常细胞，这种缺陷直接调控了圆锥角膜基质细胞降解酶活性的增强，而甲基化酶抑制剂可反转上述异常。基于此，本课题拟进一步研究：（1）采用Nrf2-ARE信号激活剂或siRNAs预处理角膜基质细胞，检测下游抗氧化基因和基质降解酶活性水平，从正反两方面验证该信号通路在圆锥角膜病变中的作用；（2）采用MeDIP-chip技术筛选，结合甲基化特异性PCR验证，确认圆锥角膜基质细胞Nrf2-ARE信号通路下游基因是否存在甲基化修饰位点，并结合甲基化酶抑制剂进行体外功能验证，阐明Nrf2-ARE信号通路活化缺陷在圆锥角膜病变中作用的分子机制，加深对圆锥角膜发病机制的认识，并为其临床治疗开拓新的研究领域和干预策略。

角膜基质细胞氧化应激和基质降解酶活性增强在圆锥角膜病变中具有重要作用，Nrf2-ARE信号通路是介导细胞抗氧化反应的关键通路。本课题研究发现，虽然圆锥角膜基质细胞核内Nrf2蛋白水平高于正常细胞，但其下游抗氧化基因NQO-1、SOD2的表达量明显低于正常细胞，这种缺陷直接调控了圆锥角膜基质细胞降解酶活性的增强，采用基因干扰技术沉默正常角膜基质细胞NQO-1基因，发现基因沉默后下游upa/upar基质降解酶表达量提高，而采用慢病毒转染技术过表达圆锥角膜基质细胞SOD2基因，发现圆锥角膜基质细胞SOD2基因过表达后，下游upa/upar基质降解酶表达量下调，说明Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化基因NQO-1、SOD2表达下调是圆锥角膜发病机理之一。.当角膜损伤时，TGFβ被激活，促使基质细胞转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞，并同时增强炎症反应，刺激胶原蛋白大量增多，引起ECM堆积，最终角膜瘢痕形成。BRD4是慢性纤维化的驱动因子，小分子化合物JQ1则是其抑制剂，本研究采用tgfβ处理人角膜基质细胞使其分化为肌成纤维细胞，在培养过程中同时添加JQ1能够抑制肌成纤维细胞的分化，另外，在tgfβ诱导肌成纤维细胞分化后再添加JQ1能够使肌成纤维细胞去分化。采用SiRNA敲除人角膜成纤维细胞系（HTK）BRD4基因，发现tgfβ诱导的纤维化分化作用显著下调，表明BRD4直接作用调节人角膜基质细胞纤维化表达。采用快刀刮除C57小鼠角膜浅基质层,建立小鼠角膜瘢痕模型，建模同时或成模后结膜下注射JQ1，发现JQ1能显著抑制或反转角膜瘢痕。同时我们发现JQ1能够抑制tgfβ引起的ROS聚集，并诱导Nrf2的核转位，激活下游NQO-1、SOD2蛋白表达。因此我们认为JQ1通过BRD4抑制及Nrf2下游抗氧化基因诱导来抑制及反转机械损伤诱导的角膜瘢痕。