抗体对映选择性识别手性农药异丙甲草胺的结构基础及分子机制

Chiral pesticides are always treated as a single substance in the detection. The preparation of chiral antibodies to recognize each enantiomer is difficult, due to the unclear mechanism of enantioselectivity between the antibody and chiral molecule. In this study, the metolachor racemates are separated to S-enantiomer and R-enantiomer. Both enantiomers and the racemate are chemically derived to prepare haptens. After a series of steps including antigen synthesis, antibody production, enzyme hydrolysis and purification, the mono-antibody Fab fragments of S-, R- and Rac- metolachors are obtained. Then the crystal structures of the Fab fragments and their complex with metolachlor enantiomers will be determined by using X-ray crystallography. By comparing the differences of interactions such as the steric hindrance and specific residues between the Fab fragments with metolachlor enantiomers, together with the results of weak interaction analysis and antibody activities, the enantioselectivity recognition mechanism will be clarified. The results of this study will not only provide guidelines for the antibody preparation and immunoassay establishment of metolachlor enantiomers, but also have significance to find out the commonness in the research of the selectively recognition between small chiral contaminants and the antibodies.

手性农药长期以来被作为单一物质进行检测，对映体水平上的手性抗体制备及其识别机制尚缺少基础研究。本项目对异丙甲草胺消旋体进行手性拆分得到S-型和R-型单体，与Rac-型异丙甲草胺一起经过抗原设计、抗体制备、酶切水解、分离纯化等步骤，分别得到S-型、R-型以及Rac-型单克隆抗体的Fab片段。利用蛋白质单晶X射线衍射技术，分别解析三种抗体Fab片段及其小分子复合体的蛋白质三维立体结构。通过对比不同构型的异丙甲草胺分子与其对应的Fab片段结合时的构象变化、立体结构差异等，同时结合分子间弱相互作用和抗体活性信息，初步阐明抗体与异丙甲草胺对映体手性选择性的识别机制。该研究的开展不仅对异丙甲草胺手性抗体的制备及免疫分析具有重要理论指导意义，而且对研究和认识其他手性小分子有害物在与抗体选择性识别中的共性问题具有重要科学意义。

本项目以手性农药异丙甲草胺为研究对象，针对其消旋和四种手性异构体共五种构型分别合成各自的抗原，免疫动物，得到了特异性的多克隆抗体及单克隆抗体，通过建立异丙甲草胺五种异构体抗原抗体识别的空间模型，结合抗体与异丙甲草胺结构类似物的识别活性差异，探讨了异丙甲草胺抗体与小分子药物的相互作用关系，揭示了异丙甲草胺抗原抗体对映选择性识别机制。取得主要成果如下:（1）拆分获得了四种异丙甲草胺对映体，ɑSS-MET、ɑSR-MET、ɑRS-MET和ɑRR-MET，合成了包括消旋异丙甲草胺在内的五种人工抗原，通过动物免疫和血清检测，均有较好的免疫应答。（2）通过杂交瘤融合筛选技术，制备了一对抗异丙甲草胺碳手性对映体的单克隆抗体，具备较好的手性选择性。（3）制备获得了抗消旋异丙甲草胺和四种对映异构体的多克隆抗体共5种，并建立了ic-ELISA检测方法，与44种结构类似物进行了识别活性评价。其中，消旋抗体的灵敏度比文献报道的高2.3倍，并且检测限能达到国标对异丙甲草胺最高残留限量的检测要求，也能满足国外饮用水检测需求，因此可应用于实际检测。（4）构建了5个抗体与异丙甲草胺不同对映体识别的空间模型，探讨了抗原抗体的相互作用关系，初步阐释了异丙甲草胺抗体识别特性与手性选择性识别机制。结果表明异丙甲草胺抗体与小分子的相互作用，存在多个结合位点，其中氯乙酰基侧链、烷氧基侧链以及手臂结构部分是较为重要的基团，对抗体识别和手性选择性有重要影响。（5）发表论文6篇，其中SCI论文4篇，中文核心2篇；申请发明专利1件。（6）项目执行期间，项目负责人沈兴被聘为学术型硕士导师，雷红涛获国家“万人计划”科技创新领军人才称号；培养硕士毕业生1名，在读硕士生3名。