果蝇生殖干细胞维持相关lncRNA的鉴定和机制研究

Adult stem cells have the ability to self-renew and differentiate to some or all of the major specialized cell types of the tissue or organ, which play critical roles in the maintenace of homeostasis. Compared with the protein encoding genes and small non-coding RNAs, little is known about the role of long non-coding RNAs (lncRNAs) in adult stem cells. Recently, although critical roles in normal biology and disease have been revealed for a subset of lncRNAs, the function of the vast majority remains untested. A central limitation of systematic efforts to evaluate lncRNA function has been the lack of simple and highly efficient tools for inhibiting lncRNA activity in vivo. We will develop a simple and effictive system for specifically knocking down lncRNA in Drosophila melanogaster based on the recently reported CRISPR/Cas13. This system consists of transgenic flies in which the expression of Cas13 is regulated by UAS and the expression of crRNA is controlled by U6 promoter. When crossed with GAL4 flies, the expression of lncRNA will be repressed in a tissue specific manner. The technology will be used to identify lncRNAs related to the regulation of germline stem cell (GSC) maintenace and differentiation, and the role of lncRNA will be further characterized by bioinformatics, genetics, cell biology, molecular and biochemical techniques.

成体干细胞对于生物体稳态的维持具有重要意义，以往的研究主要集中在蛋白编码基因和小非编码RNA方面，而关于含量远大于蛋白编码基因的长链非编码RNA（lncRNA）的研究还很少。最近越来越多的研究表明，lncRNA在正常生命过程和疾病发生中都发挥重要功能。但是由于缺乏简便高效的在体调节工具，绝大多数lncRNA的生理功能和作用机制还不清楚。本项目将利用CRISPR/Cas13系统开发一种在体内简便、高效、特异性敲低lncRNA的技术，简要流程是构建含有UAS调控表达Cas13和U6启动子驱动表达crRNA的转基因果蝇，与组织特异性GAL4果蝇杂交，从而实现对目的lncRNA的敲低。该技术将用来鉴定果蝇卵巢生殖干细胞（germline stem cells, GSCs）维持相关的lncRNA，并综合利用生物信息学、遗传学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等实验手段来研究其作用机制。

越来越多的研究报道lncRNA在生命活动中发挥重要作用，但是关于其在体内，尤其是在干细胞中的功能和作用机制的研究还很少，主要原因是缺乏高效的体内表达调控技术。本项目利用Cas13系统，开发了高效特异的果蝇体内lncRNA表达调控系统，为lncRNA功能的研究提供了有力的遗传工具。我们利用该技术构建了30株针对果蝇生殖干细胞高表达的lncRNA的转基因果蝇，筛选得到2个影响生殖干细胞维持的lncRNA。为了更好的研究lncRNA的功能，我们还优化了果蝇体内转基因激活技术，flySAM，定义了该技术中sgRNA的设计标准，将极大地促进CRISPRa基因激活技术在基因功能研究中的应用。.另外，我们还通过筛选，发现了一个能够调控生殖干细胞竞争能力的lncRNA相关蛋白，并通过细胞、遗传和生化等手段深入研究了其作用机制，发现它是通过调控JAK/STAT信号通路来影响了生殖干细胞的竞争能力。.最后，我们首次揭示了HP1c通过抑制Notch信号在正常发育和肠道稳态维持中的重要生理功能，并详细阐明了它的作用机制，大大拓展了异染色质蛋白功能以及Notch信号通路调控机制两方面的理论知识。由于HP1c是人类胃癌和结直肠癌的高风险基因，而Notch信号失调同样与肠道肿瘤的发生密切相关，该研究也为人类肠道肿瘤的早期诊断和治疗提供了参考。