miR-124和miR-27对阿尔茨海默病BACE1基因影响的分子机制

miRNA表达谱异常与阿尔茨海默病(AD)脑内BACE1水平有密切关系。miR-27、-124在AD患者和动物模型脑内表达明显下调，而脑内BACE1水平上调，机制不明。已发现miRNA参与哺乳动物的学习记忆过程，在脑神经发生和突触形成过程中起关键作用。已证实miR-27能影响过氧化物酶体增殖剂活化受体γ表达而与AD发病有关，miR-124能影响P19神经细胞的轴突生长功能。生物信息学分析提示：BACE1基因3'UTR区有miR-27、-124保守结合位点。为阐明miR-27、-124调控AD脑神经元BACE1表达的分子机制，采用miRNA基因过表达和沉默技术，通过BACE1基因克隆、双荧光素酶报告基因试验评估miR-27、-124与潜在靶标BACE1基因相互作用；阐明miR-27、-124调控AD脑神经元BACE1蛋白表达和活性、突触形成和细胞凋亡的分子机制，为AD治疗提供新的思路和依据。

采用miRNAs过表达和沉默技术，利用阿尔茨海默病(AD)细胞和小鼠模型，分析miR-124对BACE1基因表达影响和机理。脑内定位注射结合免疫荧光方法，分析miR-124对AD小鼠脑内BACE1表达影响。生物信息学方法预测了BACE1基因3'UTR区有miR-124等结合位点，双荧光素酶分析技术证实了BACE1基因为miR-124的靶标基因。构建了原代培养海马神经元和PC12细胞两种AD细胞模型，分析了miR-124对BACE1 mRNA和蛋白表达,以及细胞凋亡影响。RT-PCR结果显示Aβ诱导的AD细胞模型中miR-124表达水平明显降低，转染miR-124 mimics能逆转miR-124水平。Western blot 和免疫荧光染色结果一致揭示转染miR-124 mimics 或 inhibitors 能对应减少或增加BACE1表达。相比于miR-124 inhibitors单独转染组, Aβ诱导后转染miR-124 inhibitors组中BACE1免疫荧光阳性标记神经元明显较多。梯度对照分析发现仅转入较高miR-124剂量对BACE1表达有影响。Hoechst/PI双染、 TUNEL 分析以及MTT 分析揭示，抑制miR-124表达增加了细胞神经毒性和凋亡，在Aβ处理并转染miR-124 inhibitor组较Aβ处理并转染miR-124 mimics组细胞数量明显减少。采用APP/PS1转基因AD小鼠，脑内定位注射miR-124等，行为学分析提示AD小鼠自发活动和探索能力减弱，注射miR-124后明显改善AD小鼠行为学评分。实时定量 PCR结果揭示AD模型中miR-124表达明显降低，BACE1的蛋白表达明显升高，脑内注射miR-124后BACE1表达明显降低。免疫荧光和Western blot结果显示AD模型中的BACE1蛋白表达明显高于正常对照组，脑内注射miR-124后BACE1蛋白表达明显下降。体外研究也同时证实miR-27 下调BACE1表达。构建BACE1 的3’UTR报告载体后，共转染验证miR-124分析结合效率，双荧光素酶报告基因检测系统验证了miR-124对目的基因BACE1的抑制作用，实验验证了miR-124与BACE1的3’UTR的作用位点。本课题阐明了miR-124对BACE1基因的转录后调控机制。