CRISPR/Cas9介导Waardenburg综合征患者特异性iPSCs基因修复研究

Waardenburg Syndrome (WS) is the most common hereditary syndromic deafness in clinic; PAX3 is one of the most important pathogenic genes of WS. Gene repair based on induced pluripotent stem cells (iPSCs) provides a new idea for the treatment of WS. A systematic detection and related functional analysis of mutations in the collected WS cases were carried out previously by our research group. Based on the previous work, here we purpose to establish specific iPSCs of patients with PAX3 mutation. After in vitro gene repair using CRISPR/Cas9 gene editing technique, the specific iPSCs from these patients were differentiated to melanocytes. The effectiveness of in vitro PAX3 gene repair was explored at several levels, including gene, RNA, protein and cell function, to establish in vitro model of cell repair for iPSCs with PAX3 mutant. This study will provide essential theoretical and experimental basis for further implementation of WS gene therapy in vivo.

Waardenburg综合征（WS）是临床上最常见的遗传性综合征型耳聋，PAX3是WS的主要致病基因之一。基于诱导多潜能干细胞（iPSCs）的基因修复为治疗WS提供了新思路。课题组前期对已收集的WS病例进行了系统的突变检测和突变相关功能研究。本研究拟在前期工作基础上，建立携带PAX3突变的WS患者特异性iPSCs；联合CRISPR/Cas9基因编辑技术对来自此类患者特异性iPSCs进行体外基因修复后，定向诱导分化成黑色素细胞；从基因、RNA、蛋白及细胞功能等多个层面探讨体外PAX3基因修复的有效性，建立PAX3突变的iPSCs体外修复细胞模型。为进一步开展体内WS基因治疗提供重要的理论基础和实验依据。

Waardenburg综合征（WS）是临床上最常见的遗传性综合征型耳聋，PAX3、MITF、SOX10是其的主要致病基因。而对于WS导致的耳聋，临床上缺乏特效治疗方法。基于诱导多潜能干细胞（iPSCs）的基因修复为生物学治疗WS提供了新思路。课题组前期对既往所收集的WS病例进行了系统的突变检测和体外突变相关功能研究。本研究在前期工作基础上，继续开展WS病例。在取得患者的体细胞样本后，先后建立了携带PAX3、MITF、SOX10突变的WS患者特异性的多株iPSCs细胞株。并通过干细胞特异表达基因和蛋白标志物、拟胚体和畸胎瘤等方法验证了其多能性。进而按照内耳血管纹中间细胞发育方向，将ips细胞分阶段定向诱导分化成神经嵴细胞和黑素细胞，并成功构建出了三个突变基因的WS体外疾病模型。通过与正常组ips细胞的分化对照，发现携带三种突变的WS患者的ips细胞在分化过程虽然部分能分化成目的细胞，然而其分化效能明显减弱。主要表现在其标志物功能蛋白定量减少、诱导分化时间延长，细胞形态与功能上的变化等。此外，我们还尝试联合CRISPR/Cas9基因编辑技术对来自此类患者特异性iPSCs进行体外基因修复；实验可以观察的修复后的ips细胞株在功能蛋白定量及细胞形态与功能均得到不同程度的恢复，证实了基因修复的有效性。整体而言，本次研究基本达到了预期效果。我们建立三个基因突变的iPSCs体外疾病模型，从基因、RNA、蛋白及细胞功能等多个层面探讨其突变的致病性，并基于基因编辑技术，首次尝试了对患者特异性ips细胞株实施基因修复。为进一步开展体内WS基因治疗提供重要的理论基础和实验依据。