基于亲合色谱和质谱分析的蛋白-蛋白相互作用识别方法研究

In the proposed project, we plan to develop new affinity chromatographic techniques for quickly identifying protein-protein interactions in the proteome scale. We propose a “plug and play” strategy for immobilization of the “bait protein” in the monolith to capture the protein complexes in the cell lysate. The “bait protein” can be immobilized in the monolithic bed in the format of metal chelate. The purified proteins can be identified with the mass spectrometry-based proteomic technique. In order to accelerate the protein-protein interaction recognition process, we will try the tryptic digestion of the cell lysate to replace the intact proteins for identifying the protien-protein interactions. The resulting peptides will captured on the affinity column, these strongly retained peptides can be identified by mass spectrometry giving the represented proteins. In combination with bioinformatics, biochemistry and molecular biology, the protein-protein interaction network can be unraveled. The project will provide a powerful technique which can be used for discovering new protein-protein interactions, which may be relevant to the key biologic and clinic pathway. Once we find such key protein-protein interactions, screening of small molecule inhibitor of protein—protein interaction will be performed.

本项目拟开展新的快速检测蛋白-蛋白相互作用的亲和色谱技术，用于蛋白组规模的蛋白-蛋白相互作用的研究。发展一类亲和整体柱技术的制备方法， 即采用“即插即用”式的蛋白质固定化策略，将“诱饵”蛋白以金属螯合的方式固定在整体柱上，从人类细胞裂解液中富集纯化蛋白-蛋白复合物， 然后用基于质谱的蛋白组学技术进行鉴定。为了加快蛋白-蛋白相互作用的识别过程，用酶解肽段替代完整的蛋白质进行蛋白-蛋白相互作用的识别， 即预先将细胞裂解液进行胰蛋白酶解，然后用亲和色谱分离测定强结合的肽段， 通过质谱鉴定肽段序列，确定蛋白。结合生物信息学，生化和分子生物学技术对得到的蛋白-蛋白相互作用进行验证。这项目将为发现具有重要生物学和医学意义的蛋白-蛋白相互作用提供强有力的技术。 一旦发现这样的蛋白-蛋白相互作用，我们就可以开展蛋白-蛋白相互作用的抑制剂的筛选。

很多重要的细胞过程中，蛋白质都是通过形成复合物行使各种功能，因此蛋白-蛋白质相互作用 (PPI) 在生命过程中起着至关重要的作用。破译PPI是了解蛋白质功能和发现新的治疗靶点的基础。虽然，免疫共沉淀 (co-IP) 和酵母双杂交是分析PPI的标准方法，但是这些技术无法在蛋白组层面实现高通量的分析。近10年来，亲和纯化结合质谱 (AP-MS) 逐渐成为在蛋白质组规模上无偏差鉴定PPI的有力工具，但是常用的串联亲和纯化（TAP）技术需要很复杂的分子生物学实验，而且无法检测瞬态和动态PPI，此外，活细胞中标记蛋白的过度表达可能导致蛋白质错误折叠和聚集，从而改变细胞微环境。因此，高通量研究PPI依然是一件具有挑战性的工作。 .在本项目中，我们发展了研究PPI的新的亲和纯化方法，结合非标定量蛋白组学分析实现高通量并且准确的PPI鉴定方法，用于研究细胞自噬和凋亡过程中一些未知的作用机理。我们在20 µL塑料移液管尖端采用光引发共聚制备了Spin-tip 微型的固定化金属亲和色谱柱 (m-IMAC)。带有His6-标签的蛋白可以方便地通过Ni- NTA螯合作用固定在亲和柱上，然后用细胞裂解液通过色谱柱，被亲和色谱柱富集的细胞中的相互作用蛋白可以用含有咪唑的缓冲液通过离心机轻松快速地洗脱，然后用质谱分析鉴定。我们应用这一方法研究了哺乳动物自噬体转运的自噬接头蛋白FYCO1的 GOLD 结构域的未知功能。鉴定了 96 个 FYCO1 GOLD 结构域结合蛋白，包括先前报道的两种 FYCO1 结合蛋白 CCZ1 和 MON1A。 FYCO1 GOLD 和 CCZ1 之间的特异性相互作用通过免疫共沉淀试验进一步验证。我们进一步发展了一种毛细管亲和色谱柱（cm-IMAC）结合质谱分析用于蛋白组层面无差异的蛋白-蛋白相互作用的分析方法用于细胞凋亡过程相关的PPI。从2396 种蛋白质中以高可信度区分67 个 Bcl-XL 相互作用蛋白，包括已知的 Bcl-XL 相互作用蛋白、BID、BAK1、BCL2L11。我们用免疫共沉淀的方法对共表达的结果进行了验证，证明Bcl-XL可以与HEK293T 细胞中的 LYN 发生相互作用。.我们还将这一技术用于研究小分子药物与蛋白的相互作用。