N6-甲基腺嘌呤修饰介导TGF-β自反馈在肿瘤转移中的作用及分子机制

The most abundant internal mRNA modification is N6-methyladenosine (m6A) in eukaryotes, which modulates various biological processes via multiple mechanisms. TGF-β is the key factor regulating metastasis in cancer cells, and its expression is positively self-regulated. Our preliminary data showed a significant increase of m6A levels in TGF-β-induced EMT cells, indicating that m6A is associated to tumor metastasis process. Meanwhile, m6A levels on TGF-β mRNA increased significantly in EMT cells, while the self-feedback of TGF-β expression was inhibited in METTL3 knockout cells, suggesting that TGF-β self-regulation is mediated by its m6A modification. This study proposal is aiming to identify the m6A site(s) on TGF-β mRNA, which modulate(s) the self-feedback of TGF-β, and investigate the mechanism of how TGF-β self-feedback regulates tumor metastasis process via m6A modulation. In details, RNA biosynthesis, splicing, nuclear export, translation, tRNA recognition, RNA stability and degradation will be investigated. This study will provide new insight of tumor development via RNA modifications, which will establish the theoretical basis and novel directions of tumor therapy.

N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核生物mRNA中最常见的转录后修饰，对其细胞生物学行为具有重要调控作用。转化生长因子TGF-β是肿瘤细胞侵袭转移重要促进因子，其可促进自身表达，在肿瘤细胞中呈自反馈调控。我们研究发现TGF-β诱导肿瘤细胞上皮间质化（EMT）后m6A显著上调，敲除甲基化酶METTL3后可逆转TGF-β诱导的EMT，提示m6A参与肿瘤转移。同时EMT过程中TGF-βmRNA自身m6A显著上调，而METTL3敲除可阻断TGF-β自反馈，表明m6A可介导TGF-β自反馈并促肿瘤转移。本研究拟确证m6A调控TGF-β自反馈的关键位点，并从RNA生成、剪切、出入核、核糖体结合、翻译延伸速率、RNA稳定性及降解等层面出发，系统解析m6A调控TGF-β自反馈及其促肿瘤转移的分子机制，从而揭示RNA表观遗传机制介导TGF-β自反馈促肿瘤EMT作用，并为探讨肿瘤转移提供新的理论基础及研究方向。

m6A修饰是肿瘤转移的重要促进因素。前期研究表明，m6A修饰通过上调Snail表达促进肿瘤细胞上皮间充质转化(EMT)。本项目以细胞生长因子TGFβ1为研究对象，确证了m6A参与TGF-β自反馈，且甲基化转移酶METTL3在TGFβ1诱导的EMT过程中起关键促进作用。通过研究m6A修饰对TGF-β mRNA生物学行为的影响，发现METTL3与去甲基化酶ALKBH5均调控TGFβ1表达，其中m6A修饰促进TGFβ1 mRNA降解和TGFβ1翻译，最终促进TGFβ1在肿瘤细胞中的表达。我们进一步发现METTL3可促进TGFβ1蛋白稳定性及其二聚体的形成，最终促使TGFβ1在肿瘤EMT过程中持续分泌，为肿瘤细胞的EMT转化提供持续信号刺激。此外，我们发现Snail是EMT过程中TGFβ1/SMAD2信号激活的关键因子，而m6A修饰则是关键调控因素之一。本课题研究完善了m6A修饰在肿瘤细胞EMT调控中实现持续恶行发展的新机制，为 m6A修饰促进肿瘤转移提供了新的理论基础。通过本项目的资助，我们还同时开展了m6A修饰调控肿瘤发生发展的相关机制研究、m6A修饰作为肿瘤标志物可能性的研究、以及靶向m6A修饰治疗肿瘤的治疗策略研发。相关研究主要包括：a）m6A可在在mRNA和蛋白质层面调控β-catenin表达和细胞膜定位，从而调控肿瘤细胞运动能力；b）tRNA去甲基化后可生产可生成tRNA片段，其中5′-tRF-GlyCCC在直肠癌患者显著升高（AUC 0.882），其显著优于目前的临床应用指标，具有作为结直肠癌诊断分子标志物的潜力；c）我们构建了靶向mRNA m6A去甲基化的编辑工具，首次实现针对单基因的特异性甲基化消除。分别靶向关键癌基因MYC、EGFR和关键糖酵解基因PDK4去甲基化后，可显著抑制肿瘤细胞增殖和能量代谢。本技术被最近的综述评价为令人兴奋的甲基化编辑工具，在基因调控及相关疾病的细胞治疗上具有重要潜力。基于本项目的资助，共发表学术论文12篇，其中中科院一区文章10篇，申请发明专利2项。通过系列探讨，我们系统阐述了m6A修饰在肿瘤发生发展中具有多方面的调控功能，并初步确定了若干关键靶点。通过深入研究，我们发现特异性去除关键靶基因的m6A修饰可以有效抑制肿瘤增殖。因此，靶向m6A修饰的特异性编辑有望成为新型肿瘤防治的新方向。