圈卷产色链霉菌隐性次级代谢基因簇的调控机制

The regulation of secondary metabolite biosynthesis in Streptomyces is one of the forefront subject in microbiology research. In which, the activation of cryptic secondary metabolite biosynthesis gene cluster has gradually become very important focus. This project is aimed to study the negative regulatory genes, which repress the expression of cryptic gene clusters in Streptomyces ansochromogenes. We are inteseted in studying the genes encoding for the negative regulators (or regulatory factors) which are not only the pathway-specific transcriptional regulatory genes, but also the pleiotropic and the global regulatory genes and trying to activate the expression of the cryptic gene clusters by the genetic manipulation on these negative regulatory genes. Based on the draft map of the genome sequencing of S.ansochromogenes, we are going to predict and identify the secendary metabolic gene clusters among the genome, and to detect the transcription information of the "core genes" in these gene clusters. We will focus on those "silent" gene clusters. By using the constructed reporting system combined with transposon mutagenesis strategy, we will try to screen those mutant clones in which the "silent" gene cluster is activated through the whole mutation library. As the consequence, the mutant genes will be cloned and studied in depth for their functions and molecular mechenism. Hopefully We can get some novel componuds (antibiotics) and provide important evidence for the activation of cryptic secondary metabolite biosynthesis gene cluster in Streptomyces or actinomycetes.

链霉菌次级代谢产物生物合成的调控是当今微生物学研究的一个前沿领域，而其中隐性次级代谢产物合成基因簇的挖掘已逐渐成为这一领域的研究热点。本申请项目拟以圈卷产色链霉菌为主要研究材料，针对抑制沉默的隐性基因簇表达的负调控因子进行探索性研究，以期获得包括位于基因簇内的途径特异性负调控因子及位于基因簇外的多效调控因子及全局性调控因子，再通过对这些负调控因子的遗传操作来激活不表达的隐性基因簇的转录。研究拟在已完成圈卷产色链霉菌基因组全序列测定基础上，鉴定次级代谢产物生物合成基因簇，及各基因簇的关键合成基因的转录情况，针对不表达的隐性基因簇，通过报告系统结合转座子突变策略，筛选到能使隐性基因簇表达的突变克隆，进而得到相应的突变基因，并进行深入的功能与调控机制的研究。以期获得一些具有共性的负调控机制，为链霉菌隐性基因簇激活、获得新型抗生素提供重要的依据。

链霉菌基因组中存在大量的隐性次级代谢产物生物合成基因簇，对这些隐性基因簇的激活是获得新型抗生素的一个有效途径，对本实验室的圈卷产色链霉菌基因组序列分析表明，其中存在十几个隐性次级代谢产物生物合成基因簇，是发掘新型次级代谢产物的良好研究材料。.AdpA是链霉菌中普遍存在的全局性调控子，它既影响形态分化又调控次级代谢产物的生物合成。对圈卷产色链霉菌adpA的研究表明，其基因阻断不但影响了气生菌丝的形成，而且也影响了尼可霉素的产生，同时该突变株的发酵液显示了抑制金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌的活性，此抑菌活性是野生型发酵液所不具有的。通过对野生型和ΔadpA中次级代谢产物生物合成基因簇的转录分析，发现II型聚酮类生物合成基因簇pks7在ΔadpA中被激活了，该基因簇与oviedomycin生物合成基因簇同源性高达95%以上。通过HPLC分析和活性检测，我们在ΔadpA发酵液中发现了一个有生物活性的新吸收峰。经过大规模发酵和柱层析纯化了该化合物，对其进行了质谱和核磁共振分析，确定该化合物是oviedomycin。并且通过在天蓝色链霉菌M1146中异源表达pks7，确定了它是oviedomycin的生物合成基因簇。.通过在圈卷产色链霉菌野生型和ΔadpA中对oviedomycin生物合成基因簇内的6个调控基因进行阻断，确定了ovmZ、ovmW和ovmR是与oviedomycin生物合成中的正调控基因。通过组成型高表达ovmZ、ovmW、ovmR和共同高表达ovmZ、ovmW确定了OvmZ和OvmW是在oviedomycin生物合成中协同发挥作用的激活子。EMSA和Footprinting实验确定了AdpA直接调控ovmZ和ovmW的启动子区，进而通过gusA介导的体内报告系统，我们确定了OvmZ和OvmW能直接作用oviedomycin生物合成的结构基因ovmOI启动子区来调控oviedomycin的生物合成。.进一步对ovmZ和ovmW的生物信息学研究发现，它们的同源基因广泛存在于多种放线菌的不同生物合成基因簇中，包括本实验室保藏的一株已有基因组序列的菌株，在该菌株中组成型共表达这两个同源基因，能使该菌中的Furaquinocin隐性基因簇激活，说明对这两个基因的同源基因进行遗传操作对激活隐性基因簇具有一定的普适作用。