病程相关蛋白激酶（GhPR5K）调控棉花抗黄萎病的分子机制

The use of resistant varieties is an economical and effective way of controlling Verticillium wilt disease. Previously, a receptor like protein kinase (RLKs) Gh_D04G1868 (named as GhPR5K) was detected in cotton root phosphorylated proteins, its phosphorylation level was significant higher in Zhongzhimian 2 inoculated than that in control (12.69 folds), while it was not significant in Jimian 11. The gene knockout (VIGS) and functional complementation assay showed that the GhPR5K could improves cotton resistance to Verticillium wilt. In this study, the gene and phosphorylated protein expression level will be analysied by qRT-PCR and Quadrupole-MS in different resistant varieties. The secondary metabolites (lignin, callose), signal pathways of Salicylic, Ethylene, Jasmonic, H2O2/NO, and the gene expression in this metabolic pathways will be detected. Moreover, to prove the mechanism of GhPR5K regulate cotton resistant to Verticillium wilt, the protein in cotton specific targeting by GhPR5K will be detected by Yeast-two hybrid (Y2H), Bimolecular fluorescence complementation (BiFC), Co-Immunoprecipitation (Co-IP) and pull down. Furtherly, we plan to examine the phosphorylation of interaction, and the conserved phosphorylation sites, to explore how the GhPR5K regulate plant immunity signal pathways. This project will provide base for more effective and targeted cotton resistant breeding.

培育抗病品种是棉花黄萎病防治最经济有效的措施，棉花的抗病机制是抗病育种关键及核心问题。前期通过抗、感病品种根部磷酸化蛋白质组学分析，筛选到一个类受体蛋白激酶Gh_D04G1868（命名为GhPR5K），研究表明GhPR5K基因提高了棉花对黄萎病的抗性。本项目拟分析GhPR5K激活的相关次生代谢产物变化及细胞信号传导途径上标记基因的表达，解析GhPR5K调控的棉花抗病反应途径；利用qRT-PCR和平行反应监测（PRM）的方法分析GhPR5K基因和磷酸化GhPR5K在不同抗性品种根部的应激表达，解析GhPR5K磷酸化水平与抗病性的关系；将GhPR5K转化棉花原生质体，分析GhPR5K的亚细胞定位；通过酵母双杂交等筛选与GhPR5K互作的靶蛋白，分析GhPR5K磷酸化作用及关键位点，解析GhPR5K与其互作蛋白的作用机理，阐明GhPR5K调控棉花抗黄萎病的分子机制，为棉花抗病育种提供理论依据。

棉花黄萎病（Verticillium Wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的一种土传性真菌维管束病害，引起植物维管束褐变，叶片萎蔫、脱落，甚至导致植株死亡。已经成为我国棉花可持续生产的主要障碍之一，尚很难得到有效控制，而培育和种植抗病品种是防治棉花黄萎病最经济有效的途径。越来越多的证据表明，植物细胞壁相关受体激酶(WAKs)参与了调控了植物对病原菌攻击的防御反应，但其相关的信号传导过程和调控机制尚不清楚。前期通过磷酸化蛋白质组学分析，鉴定到一个类受体蛋白激酶Gh_D04G1868 （重新命名为GhWAKL）,其在抗病品种中植棉2号处理组与对照组间的差异倍数最高，达到了12.69，而在冀棉11号处理组与对照组间的差异不显著。而且，大丽轮枝菌和水杨酸（SA）可以显著诱导GhWAKL基因的表达。利用VIGS技术沉默GhWAKL基因后，显著降低了棉花根部SA含量，抑制了SA介导的防御反应，增强棉花对V. dahliae的敏感性。在拟南芥中过表达GhWAKL基因能够显著提高拟南芥对大丽轮枝菌的抗性。通过酵母双杂交技术及BIFC证实GhWAKL与蛋白GhDNAJ1（HSP40）互作，去除信号肽的GhWAKL蛋白不能和GhDNAJ蛋白形成互作。亚细胞定位分析表明GhWAKL蛋白定位在细胞膜上，而GhDNAJ1蛋白定位于细胞核和细胞膜，融合蛋白GhWAKL-GFP和GhDNAJ1-mCharry在烟草细胞中的共表达表明共定位于细胞膜上。利用磷酸化位点突变表明GhWAKL蛋白S628磷酸化位点的突变影响了其与GhDNAJ1蛋白的互作。过表达拟南芥OE-GhWAKL，OE-GhWAKLS627A, OE-GhWAKLS628A 和OE-GhWAKLS627A&S628A株系的病情指数分别为29.4，38.7，64.4和66.9。表明GhWAKL蛋白S628磷酸化位点的突变抑制了其调控植物抗病性的功能，S628是GhWAKL蛋白关键性的磷酸化位点。该研究证明了GhWAKL基因在棉花抗黄萎病方面的功能，为棉花的抗病育种提供了可靠的候选基因。