HBx调控lncRNA介导的上皮间质转化与肝癌侵袭转移的关系

Hepatitis B virus X protein (HBx) plays an important role during the invasion and metastasis of HBV related hepatocellular carcinoma (HCC). However, the precise mechanism remains unclear. HBx might promote the invasion and metastasis of tumor by regulating epithelial-mesenchymal transition (EMT) according to references and the result of our previous study, and long non-coding RNA (lncRNA), as a kind of new regulators, might have an central role during the process. The main content is as follow: the effect of HBx (both wild type and carboxyl terminal deletion mutant) on EMT of HCC cell will be assessed by detecting the HCC cell morphous, ability of cell migration and the expression of EMT markers at human tissue, cell and animal levels; the lncRNA regulated by HBx and the underlying biological pathway will be screened using lncRNA microarray and chromatin immunoprecipitation assay, meanwhile, RNA pull down assay, RNA-binding protein immunoprecipitation, realtime PCR and western blot will be used to identify the molecular mechanism by which lncRNA controls the EMT of HCC cell. With the completion of this project, the effect and mechanism of HBx regulating EMT through lncRNA in HCC cells will be illuminated. It will help us to find new target to inhibit the invasion and metastasis of HCC cell.

乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）在乙肝相关性肝癌的侵袭转移过程中发挥重要作用，但其确切机制尚未阐明。现有文献和前期实验结果提示，HBx可能通过调控上皮间质转化（EMT）促进肝癌细胞侵袭转移，而长链非编码RNA（lncRNA）作为一类新近认识的调控因子极有可能在此过程中发挥显著作用。本项目拟在人体组织、细胞和实验动物水平检测野生型和羧基端缺失突变型HBx对肝癌细胞形态、转移能力及EMT标志物的影响，从而判断HBx对肝癌细胞EMT的调控作用；利用lncRNA芯片和染色质免疫共沉淀筛选出HBx调控的lncRNA和潜在发挥作用的生物学通路，同时利用RNA pull down、RNA免疫共沉淀、实时荧光定量PCR和免疫印迹等方法明确lncRNA调控肝癌细胞EMT的分子机制。本项目的完成将阐明HBx调控lncRNA介导的EMT在肝癌侵袭转移过程中的作用和具体机制，进而为抑制肝癌转移发掘新的调控靶点。

乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）在乙肝相关性肝癌的侵袭转移过程中发挥重要作用，但其确切机制尚未阐明。现有文献和前期实验结果提示，HBX可能通过调控上皮间质转化（EMT）促进肝癌细胞侵袭转移，而长链非编码RNA（lncRNA）作为一类新近认识的调控因子极有可能在此过程中发挥显著作用。为了探究HBX是否会通过调控lncRNA的表达来促进肝癌的EMT过程，本项目进行了一系列的体内外实验。首先，利用免疫组织化学方法检测肝癌组织中HBX、上皮性标志物E-cadherin和间充质性标记物Vimentin的表达水平，初步判断HBX与EMT的相关性。然后，构建全长HBX和羧基端截短型HBX过表达HepG2细胞系，通过显微镜观察细胞形态变化、transwell检测侵袭转移能力以及westernblot 检测转染细胞中HBX和EMT标志物的变化，判断HBX是否促进了肝癌细胞发生EMT。同时，将转染细胞通过尾静脉注入裸鼠体内，比较不同组间转移瘤形成的数量和大小。最后，通过高通量芯片技术分析HBX转染细胞和对照细胞lncRNA和mRNA的表达差异，筛选出可能由HBX调控的lncRNA及与lncRNA相关的、并与EMT调控有关的mRNA，再利用多种分子生物学技术对筛选到的lncRNA及下游信号通路进行功能验证和机制分析。现有的研究结果显示，在肝癌组织中，HBX的表达水平与E-cadherin呈负相关，而与Vimentin呈正相关。与此同时，细胞的体外研究和裸鼠体内研究证实，HBX能诱导HepG2细胞由上皮形态向间充质形态转变，并导致细胞侵袭转移能力增强。蛋白检测证实，HBX可以下调E-cadherin的表达，而上调Vimentin的水平。羧基端截短型HBX可能对EMT具有略强的诱导作用。lncRNA芯片结果显示，HBX影响了细胞内lncRNA的表达水平，real time PCR对芯片结果进行了验证。目前已经筛选到几个与上皮间质转化相关的lncRNA，并正在进行功能验证和机制研究。总之，本项目研究结果显示，HBX能通过调控EMT过程而促进肝癌细胞的侵袭转移能力，而lncRNA在其中发挥重要介导作用。本项目的完成将阐明HBx调控lncRNA介导的EMT在肝癌侵袭转移过程中的作用和具体机制，进而为抑制肝癌转移发掘新的调控靶点。