负荷响应启动子介导的抗骨骼肌废用性萎缩研究

骨骼肌去负荷导致的废用性萎缩仍无特异治疗药物，探索生物技术干预手段是实现有效治疗的重要途径。去负荷后肌细胞自身表达的MSTN（肌肉生长抑制素）逐渐上调，引发萎缩，是重要的促萎缩蛋白。基因水平，MSTN基因表达受上游启动子（PM）的控制，PM能感应肌肉负荷变化，去负荷时上调受控基因的表达，反之下调。蛋白水平，发现截短的MSTN蛋白前半段（M前肽）能与MSTN竞争，反而具有抗萎缩作用。.本研究设想在骨骼肌细胞中临时建立抗萎缩自动调节系统：人为引入PM调控下的M前肽基因表达系统，使M前肽基因与肌细胞中已有的PM调控下的MSTN基因一样受PM调控，在PM操纵下M前肽与MSTN同步表达，实时抑制MSTN活性。为此，拟构建基因表达载体，把PM引入载体并把M前肽基因克隆在其下游。载体导入肌细胞后，当骨骼肌感应变化并启动MSTN表达的同时，M前肽的表达也启动，以M前肽表达的动态响应，实现抗萎缩的自动调节。

骨骼肌萎缩目前仍无特异治疗药物，探索生物技术干预手段，是实现有效治疗的重要途径。本课题将一个具有感应骨骼肌负荷变化的启动子（PM）与一个编码抗萎缩蛋白（突变型MSTN前肽，简称mM前肽）的基因结合，构建了具有依据骨骼肌负荷变化动态表达抗萎缩蛋白的基因表达载体。观察载体导入骨骼肌后，抗萎缩蛋白的表达能否依据重力负荷的变化而增加，并对其抗萎缩活性进行初步的探讨。研究结果基本上实现了预期的目标。（1）克隆了MSTN前肽的cDNA。（2） 对MSTN前肽基因进行突变(第227位A突变为C)，获得了突变型的MSTN前肽（mM前肽）。（3）采用基因重组方法，表达重组的mM蛋白；该蛋白作用于小鼠，证实具有促进骨骼肌增殖，抗萎缩活性。（4）克隆出了调控MSTN表达的启动子基因（PM）,分别构建出了PM调控下的荧光素酶表达载体以及PM调控下的mM前肽表达载体。（5）证实了PM在肌细胞中具有感应重力负荷变化的特点：‘PM-荧光素酶’转染的肌细胞在模拟失重条件下，荧光素酶基因表达水平提高； （6）观察到了PM调控下的mM前肽表达具有随负荷减少而增加的特征： ‘PM-mM前肽’载体转染的肌细胞，在模拟失重条件下，mM前肽的表达水平与荧光素酶类似，随着负荷的减少，mM前肽的表达量增加。（7）通过转染有‘PM-mM前肽’载体肌细胞的模拟失重实验，证实表达的mM前肽可以对抗模拟失重导致肌细胞增殖下降的作用。（8）‘PM-mM前肽’载体质粒导入后肢骨骼肌萎缩小鼠模型后，发现后肢骨骼肌注射‘PM-mM前肽’载体后，具有对抗骨骼肌萎缩的作用，但注射的剂量需达到较大剂量时才能观察到抗萎缩作用。本研究结果将为深入探讨骨骼肌萎缩的生物学治疗奠定基础。