医用臭氧介导PI3K/AKT/mTOR和AMPK/mTOR通路对骨性关节炎自噬调节及镇痛机制研究

Cartilage degeneration and chronic inflammation are the main pathologic features of Osteoarthritis (OA). Joint swelling and chronic pain which are the clinical manifestations may lead neuropathic pain which affects the quality of life. The current study shows that one of the pathogenesis of OA is the decline of autophagy in chondrocytes, and the level of autophagy in neurons is connected to neuropathic pain. Intra-articular injection of medical ozone can effectively treat OA. However, its mechanism is unclear. The pre-experiment found that medical ozone could improve the level of autophagy in OA chondrocytes. We hypothesize that medical ozone can improve autophagy of chondrocytes which is one of the mechanisms of treatment OA. In this study, we will investigate the effects of different concentrations of medical ozone on OA model in vitro and in vivo. The autophagy-related genes LC3Ⅱand p62, the autophagy-related signaling pathways PI3K / AKT / mTOR and AMPK / mTOR, inflammatory response and pain behavior will be detected by transmission electron microscopy, qRT-PCR, immunofluorescence double labeling, ELISA and patch clamp technique. We will explore the possible mechanism of medical ozone on OA treatment from the whole, cell and molecular levels. We will provide adequate experimental basis for medical ozone on the treatment of OA.

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）以软骨退变和慢性炎症为病理特点，临床表现为关节肿胀和慢性疼痛，严重者可导致神经病理性疼痛。目前研究表明OA发病机制之一是软骨细胞自噬水平的下降，而神经病理性疼痛的发生与中枢神经元细胞自噬水平息息相关。医用臭氧的注射可有效治疗OA，但其机制尚不明确，课题组前期预实验发现医用臭氧可提高OA的软骨细胞自噬水平，由此提出假设医用臭氧提高OA软骨细胞自噬水平是治疗OA机制之一。本研究拟将不同浓度医用臭氧分别体内外干预OA细胞模型和动物模型，采用透射电镜、qRT-PCR、免疫荧光双标、ELISA法和膜片钳技术等检测上述模型自噬相关基因LC3Ⅱ和p62、PI3K/AKT/mTOR和AMPK/mTOR自噬相关信号通路、细胞功能、炎性反应、疼痛行为学等变化，从整体、细胞、分子水平探讨医用臭氧对OA治疗可能的作用机制，为医用臭氧对OA的治疗提供充足的实验依据。

近年医用臭氧注射技术在疼痛临床中均显示了良好的应用前景。本研究探究了医用臭氧对骨关节炎治疗和镇痛机制。前期动物实验研究发现，关节腔内注射30 μg/mL医用臭氧可抑制OA大鼠软骨中MMP-13表达和collagen 2降解，延缓OA的软骨退变；降低OA大鼠血清中IL-6和TNF-α的浓度，发挥抗炎作用；关节腔注射30 μg/mL医用臭氧上调OA大鼠软骨细胞自噬水平，该调节作用可能依赖于激活AMPK/mTOR信号通路。此外，关节腔注射30 μg/mL医用臭氧提高OA大鼠的疼痛阈值，发挥镇痛作用，可能与激活OA大鼠脊髓背角AMPK有关，这可能是医用臭氧对OA大鼠镇痛作用的中枢机制。体外细胞实验进一步探讨医用臭氧对OA软骨细胞治疗的分子生物学机制我们的研究发现，30 μg/mL的医用臭氧提高IL-1β诱导的软骨细胞的细胞活性；抑制IL-1β诱导的软骨细胞IL-6和TNF-α mRNA转录水平，发挥抗炎作用；下调IL-1β诱导的软骨细胞中MMP-13并上调TIMP-1mRNA转录水平，调节软骨细胞的合成分解代谢的平衡；AMPK抑制剂com C可阻断医用臭氧对IL-1β诱导的软骨细胞的自噬上调；我们的研究证明30 μg/mL的医用臭氧介导AMPK/mTOR信号通路提高IL-1β诱导的软骨细胞的自噬，从而发挥提高细胞活性、抗炎、调节软骨细胞代谢平衡等作用。. 通过进一步研究发现，30 μg/mL医用臭氧提高OA软骨细胞的细胞活力, 50 μg/mL和70 μg/mL医用臭氧抑制OA软骨细胞活力；30 μg/mL医用臭氧促进OA软骨细胞PPARγ表达，改善OA软骨细胞的自噬水平。我们的研究结果证明。PPARγ通过调节mTOR自噬信号传导途径在软骨细胞中起保护作用，30 μg/mL医用臭氧通过PPARγ/mTOR信号通路提高OA软骨细胞的自噬。为医用臭氧在临床中有效安全的应用提供了分子生物学依据。 . 此外，高浓度医用臭氧对正常组织产生毒性，可能引起神经损伤。因此我们还探究了医用臭氧引起神经损伤的机制。研究发现，医用臭氧（40 μg/mL）可能通过P62/NRF2/ARE信号通路干扰NRF2入核原代神经元造成损伤。本研究结果为临床安全应用医用臭氧提供重要依据。