核桃埋干复幼促根过程中生长素响应基因的CpG岛甲基化重编程研究

埋干复幼实现了核桃等木本植物成龄树扦插生根（裴东等，2007年国家发明专利），但对复幼促进生根的机制缺乏深入认识。近年来研究表明，基因CpG岛甲基化重编程与复幼和生长素关系密切，而生长素又是生根关键的内源激素。本研究选取15年生核桃'强悍'品种，以经过埋干复幼获得的易生根嫩枝和成龄树上相同状态难生根嫩枝（对照）为试材，扦插诱导生根。采用同源克隆和转录组测序、同源分析方法，获得生长素响应差异表达基因，克隆其全长序列，分析其CpG岛的分布，筛选含有尤其是启动子区含有较多CpG岛的目标基因。利用BSP测序法分析目标基因在复幼过程中CpG岛的甲基化变化频率和规律，从重要或关键基因的DNA甲基化等表观遗传方面，揭示埋枝复幼促进核桃成龄品种生根的分子机制，深化对木本植物复幼和不定根发生机制的认识。

核桃(Juglans regia L. )属扦插难生根树种，成龄核桃品种更难。研究表明，通过埋干等复幼处理可以明显提高成龄核桃品种的不定根发生能力，扦插成活率达95%以上。组织形态学研究发现，核桃根原基发生于髓射线正对的形成层，属于单位点发生。运用免疫胶体金组织化学定位技术，对核桃‘中宁盛’品种不定根发生过程中IAA、ABA、GA和ZT时空分布研究发现，复幼处理不仅提高了生长素的累积水平，而且显著改变了IAA、ABA、GA和ZT的运输。生根诱导前，成熟态和幼态嫩枝插穗基部的IAA、ABA、GA和ZT均分布在韧皮部维管组织及其周围细胞中。生根诱导1d集中分布区不变，但幼态嫩枝中发生了这4类激素由筛管组织向嫩茎基部运输的现象；诱导3~5d，这4类激素的多数已转移至形成层细胞中，在部分木质部射线细胞和导管细胞的伴胞中也有分布；诱导6~9d，不定根原基形成，而成熟嫩茎基部的IAA、ABA、GA和ZT的分布位置无明显变化。在DNA甲基化研究中，筛选出了39对适用于核桃 MSAP 分析的稳定多态引物，采用 MSAP 标记对核桃埋干复幼嫩枝韧皮部组织进行DNA甲基化水平分析，共扩增出1363条清晰可辨的电泳谱带，平均每对引物扩增出35条条带。在复幼嫩枝中，检测出的DNA 甲基化修饰位点595个，甲基化比例为43.65 %，其中内侧胞嘧啶全甲基化位点441个，占全部扩增位点的32.36 %；外侧胞嘧啶半甲基化位点为158个，占全部扩增位点的11.59%。此外，复幼和成熟嫩枝总DNA甲基化（CCGG位点）均以双链甲基化为主，并且复幼嫩枝总DNA甲基化水平低于成熟态的。对获得的甲基化差异条带进行克隆和测序，得到5条反应甲基化模式变异的变异条带序列，Blast分析表明，差异条带主要与线粒体中参与编码NADH脱氢酶亚单位的基因以及编码硝酸还原酶的基因片段高度同源， 这一结果较好地解释了埋干黄化改变了细胞的能量代谢和细胞活力现象。DNA甲基化如何调控基因表达和改变代谢通路进而提高了不定根发生能力还需开展进一步研究。