NCSTN基因-Notch信号通路在反常性痤疮发病过程中的作用及其分子机制

Acne inversa (AI) is a chronic and inflammatory skin disease. The causative gene is γ-secretase, which has four subunits including is PSEN1, PSENEN, NCSTN and Aph-1. Up to now, 23 mutations of γ-secretase were reported; of which 19 appear on NCSTN subunit, indicating closely relation of NCSTN with AI disease. We cultured keratinocytes HaCaT cell, created NCSTN gene low expression cell model using RNA interference method, and carried out research as follows: (1) To assay for cell growth and apoptosis by MTT, flow cytometry and TUNEL; (2) To detect changes in the cells Notch signaling pathway using Notch Signaling Pathway PCR Array; (3) To screening molecules associated cell proliferation, keratinocytes and inflammatory by bioinformatics；(4) To detect the AI patients' mutations, and selecte patients with NCSTN mutation to validate candidate target genes by immunohistochemistry or in situ hybridization, and observe the distribution in the cell by laser scanning confocal microscopy; (5) To study AI hair angle plug and inflammation mechanisms by intervention candidate target gene expression.

反常性痤疮（AI）是一种慢性、炎症性皮肤病，γ-分泌酶是其致病基因，后者由早老素、早老素增强子-2、NCSTN和Aph-1四个亚基组成。目前，在报道的23个基因突变中，19个出现在NCSTN亚基上，可见NCSTN的改变与AI发病密切相关。本课题以培养的角质形成细胞HaCaT为基础，采用RNA干扰的方法，建立NCSTN基因低表达的角质形成细胞模型，开展如下研究：（1）通过MTT、流式细胞仪和TUNEL法检测细胞生长和凋亡；（2）利用Notch信号通路PCR芯片检测细胞中Notch信号通路重要分子的改变；（3）生物信息学筛选影响细胞增殖、角化和炎症有关的分子；（4）检测AI患者的基因突变，选取具有NCSTN基因突变患者,免疫组化验或原位杂交验证候选靶基因，激光共聚焦显微镜观察上述分子在细胞中的不同分布；（5）干预候选靶基因表达，研究AI毛发角栓和炎症的发生机制。

反常性痤疮(Acne inversa, AI; OMIM 142690)又称化脓性汗腺炎、毛囊闭锁三联征，是一种慢性复发性炎症性疾病。2010年，Wang等首先发现编码γ-分泌酶不同亚单位的基因突变可引起部分家族性AI的发生。γ-分泌酶是一种跨膜蛋白酶，包含四个必要组分，分别为：早老素(PS）、Nicastrin蛋白（nicastrin, NCT）、前咽缺陷蛋白(anterior pharynx defective-1，APH1)、早老素增强子（presenilin enhancer-2, PEN2）。PS作为催化亚基有两种亚型，分别由PS1和PS2基因编码。PS基因突变导致AβPP裂解产物Aβ多肽异常聚集被认为是家族性阿尔茨海默(Alzheimer’s) 病的病因。至今学术界已经报道在AI患者的NCT、PS1及PEN2基因上存在多种不同的突变位点，其中发生在NCT基因上的占绝大多数，多为功能缺失性突变,说明NCT亚基的改变在AI发病过程中可能有着重要作用。Notch受体在AI发病中的作用越来越受到重视。本课题通过沉默人永生化角质形成细胞HaCaT细胞中NCT基因的表达，用Notch信号通路PCR芯片检测实验组和对照组Notch信号通路下游基因mRNA的变化，为进一步明确NCT基因敲低后所引起的Notch信号通路相关RNA变化，研究其下游细胞增殖及分化相关信号通路的改变，探究其可能的调控机制，并在存在NCT基因突变的AI患者皮损标本及正常对照中比较Notch信号通路相关蛋白的差异，从而探讨NCT基因突变在AI发病中的作用，试图寻找γ-分泌酶基因突变引起AI有别于Alzheimer’s病发病的独特分子信号通路。我们发现沉默HaCaT细胞NCT基因的表达可导致角质形成细胞增殖分化相关基因的改变，并抑制γ-分泌酶复合体的活性，从而导致Notch信号通路表达及活性受损。γ-分泌酶-Notch信号转导通路缺陷导致毛囊漏斗部角质形成细胞异常增殖分化可能在AI发病中发挥重要作用。除了Notch信号通路外，可能还有其他受NCT基因调控的细胞增殖分化相关的信号通路可能在AI的发病中发挥作用。这些新发现的信号通路可能具有重要价值，值得未来进一步的详细研究。