基于半理性设计巨大芽孢杆菌碱性I型普鲁兰酶特性改善研究

Pullulanase is widely used in the field of food, especially the type I. With the development of genetic engineering technology, People have obtained some kinds of recombinant pullulanase by genetically engineered method. which increased production effectively and stability (pH stability and thermostability) to a certain extent. However, there is few enzyme characteration can fully meet the industrial needs. It was found that catalytic efficiency and substrate specificity were improved in several recombinant pullulanases as increasing enzyme stability by semi-rational design. However, the mechanism is not clear. In this study, improving of catalytic efficiency, specific activity and synthetic ability of the type I pullulanase from Bacillus megaterium and structure-activity relationship will be studied by rational design and semi-rational design (this study mainly through iterative saturation mutation method, domain truncation, domain switching), which could provide theoretical support to get more suitable pullulanase for industrial application.

普鲁兰酶广泛应用于食品领域，尤其是特异性较高的I型普鲁兰酶。随着基因工程技术的发展，人们通过基因工程手段，在一定程度上有效提高了普鲁兰酶的产量及稳定性（酸碱稳定性及热稳定性），但所产的普鲁兰酶其他酶学特性仍有缺陷，依然不能完全满足工业需求。随着研究的深入，人们发现通过半理性设计改善酶稳定性的同时，一些酶的催化效率及底物特异性有一定的提升，但其机理尚未明确。本研究以巨大芽孢杆菌I型重组普鲁兰酶为研究对象，通过理性设计及半理性设计（本研究主要通过迭代饱和突变法、结构域截短、结构域切换），提升该重组酶催化效率，比活力以及合成能力特性，研究其构效关系，为得到更适宜工业化应用的普鲁兰酶提供理论支持。

普鲁兰酶在食品工业中具有较大的应用潜力，研究表明少数I型普鲁兰酶发现具有合成特性，少数普鲁兰酶具有低温反应特性及碱性耐受性。这些普鲁兰酶构效研究并不透彻，对这些普鲁兰酶的研究求其是构效关系的研究以及其应用潜力的开发，将为普鲁兰酶的广泛应用，满足工业应用需求奠定基础。.经过四年的持续研究，基本上实现了预期的目标。主要研究内容包括：克隆表达两目标个普鲁兰酶基因，研究重组普鲁兰酶的酶学特性、水解特性及转糖苷特性；通过理性设计（定点饱和突变以及N端及C端截短）对两个普鲁兰酶进行分子改造。找到影响其酶学特性的关键位点和结构尤其是其合成特性；同时探索其工业化应用潜力。经过四年的不断研究，基本完成原定研究计划主题内容。基于以上研究内容，取得以下主要结果：.A、对巨大芽孢杆菌两个普鲁兰酶基因进行了克隆并对其基因做了催化位点，保守结构域做了相应的分析，根据基因构建了表达载体并在大肠杆菌表达菌株中予以表达。研究了重组普鲁兰酶的酶学特性、金属离子及化合物的影响、动力学参数、水解特性及转糖苷特性。对水解产物和转糖苷产物做了详尽的解析。.B、研究通过计算机模拟分析了两种酶的结构特征。分别找到了灵活环状结构，通过同源性比对找到了有可能影响酶学特性的N端及C端结构，并对其做了截短研究，得到了一定的结果，对将来深入研究打下基础。 通过分子模拟以及同源性分析，得到了有可能影响两酶的氨基酸位点。通过定点突变找了了若干对酶学特性（酶反应温度及合成能力）找到了影响酶反应温度计合成能力的部分位点。.C、研究了普鲁兰酶水解产物做为可食性膜原料在罗非鱼片保鲜中的作用，结果表明水解产物不但具有很好的成膜特性，同时具有抗氧化特性。水解产物形成的可食性膜对冰鲜罗非鱼片的品质具有较好的保持作用。.D、研究了重组普鲁兰酶作为洗涤剂添加剂的作用，结果表明但洗涤剂添加了普鲁兰酶，洗涤效果得到了明显的改善。.E、研究了重组普鲁兰酶在低温条件下制备抗性淀粉的能力，同时研究了所制备的抗性淀粉的特性并考察了抗性淀粉在面包以及米线中的应用能力，结果表明在低温下，此研究的重组普鲁兰酶具有较大的制备抗性淀粉的潜力，添加了抗性淀粉的面包和米线具有较好的品质和功能特性。.项目在研期间本项目组共发表SCI研究论文5篇，申请国家发明专利2项，培养毕业硕士6人。以上研究为普鲁兰酶的进一步研究及开发提供了依据。