TRAF2介导c-FLIP活化NF-κB信号通路调控银屑病局部增殖和炎症的作用及其机制

基于凋亡抑制蛋白c-FLIP与炎症、肿瘤、自身免疫性疾病的发生发展密切相关的文献知识，我们前期发现：通过免疫组织化学、RT-PCR和蛋白免疫印记等不同角度均证实c-FLIP在银屑病皮损和外周血T细胞中表达增高，且与角质形成细胞的增殖和凋亡相关。然而，c-FLIP在调控银屑病角质形成细胞增殖和局部炎症微环境发挥的作用及其机制尚不清楚。因此本项目拟通过基因转染和小分子RNA干扰技术，诱导或阻断角质形成细胞c-FLIP的表达，拟用报告基因分析法和免疫共沉淀等技术，探索c-FLIP对诱导角质形成细胞增殖和凋亡和对淋巴细胞活化的影响及其机制，后者包括对NF-κB信号通路的活化机制的研究。本课题首次提出c-FLIP对角质形成细胞生物学行为的影响及其诱导NF-κB信号通路活化后对银屑病局部炎症形成的作用探讨。

1、本研究通过免疫组织化学、RT-PCR 和蛋白免疫印记等不同角度均证实c-FLIP 在银屑病皮损和外周血T 细胞中表达增高，且与角质形成细胞的增殖和凋亡相关。.2、构建针对c-FLIP不同亚型的发卡样RNA真核表达载体c-FLIPT/L/S shRNA, 并转染A875细胞，证实其在体外培养的A875细胞中对c-FLIP具有干扰作用。测序结果表明发卡样的c-FLIPT/L/S shRNAs真核表达载体构建成功，转染A875细胞后获得稳定表达，并可特异性封闭c-FLIPT/L/S的表达，筛选和鉴定出稳定转染单克隆细胞系A875，为后续实验及进一步研究c-FLIPT/L/S shRNAs载体在治疗中的作用提供了理论基础。.3、与未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPC shRNA 真核表达载体的A875细胞相比， c-FLIPT/LshRNAs真核表达载体稳转的A875 中p-JNK表达水平明显升高，而 c-FLIPS-shRNA真核表达载体稳转的A875 中p-JNK表达水平无明显变化。在A875细胞系中下调c-FLIP的表达可以诱导JNK信号途径的活化。 .4、稳定转染c-FLIPT/L/SshRNA A875细胞生长速度较未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPC shRNA A875细胞的生长速度慢，进入对数生长期的时间延长且平台降低。与未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPC shRNA 真核表达载体的A875细胞相比，稳定转染c-FLIPT/L/S shRNA真核表达载体的A875细胞光密度值明显降低。运用Annexinⅴ/PI双染，流式细胞术检测细胞凋亡显示与未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPC shRNA 真核表达载体的A875细胞相比，稳定转染c-FLIPT/L/S shRNA真核表达载体的A875细胞凋亡率明显增加。靶向c-FLIP基因不同亚型的shRNA不仅对A875细胞的生长和增殖具有抑制作用，而且能够促进细胞的凋亡.5、在蛋白水平上研究A375和Skmel-l细胞系中cFLIP与NF-κBp65的表达。选择cFLIP表达较低的A375细胞系，转染pCMV-Tag2B-cFLIPp43表达载体，筛选稳定表达cFLIPp43的A375细胞系。探讨转染pCMV-Tag2B-cFLIPp43表达载体的A375细胞系中