酉州乌羊皮肤黑色素高度沉积性状致因突变的鉴定及功能研究

Youzhou dark goat (Capra hircus) is an unique mammalian species featuring the dark skin of body including the visible mucous membranes and general white coat color, which is a rare fibromelanosis and has previously been reported only in Silky fowl. Our preliminary study indicates that the dark-skin phenotype for Youzhou dark goat is associated with the hypernomic sediment of melanin in skin. However, the genetic model and the molecular mechanism underlying this special phenotype has not been known presently, which hinders the development and utilization of this valuable indigenous goat breed further. Based on having built the genetic pedigree of skin color and the GBS (genotyping by sequencing) technology, we would perform the LDLA analysis to finely identify the candidate genes involved in the skin pigmentation. Subsequently, we would identify and validate the causative mutation by examining the association between the individual SNP/haplotype and skin pigmentation. Finally, the function of candidate gene will be examined at different levels in the present study. Our study will not only contribute to innovation of germplasm resource and marker assisted selection(MAS) in Youzhou dark goat, but also provide valuable information for human diseases associated with pigment, such as skin melanopathy, melanosis coli, Mucosal melanosis ,etc.

酉州乌羊是迄今为止人们发现的唯一一种全身皮肤及可视粘膜为乌黑色的哺乳动物物种，这种表型是一类罕见的纤维色素增生（fibromelanosis）现象，此前仅在家禽中遇见过。但截至目前对酉州乌羊皮肤黑色素高度沉积性状的遗传模式及其分子机制还不清楚。本项目在前期工作的基础上，一方面，对酉州乌羊皮肤色素性状进行经典的遗传学分析，鉴定其遗传模式；另一方面，应用基于GBS技术产生的全基因组高密度SNP标记，通过连锁不平衡-连锁分析精细定位酉州乌羊皮肤色素性状的候选基因，通过关联性分析确定候选基因的致因突变位点；随后，分别在群体与细胞水平对候选基因的功能进行研究，深入剖析酉州乌羊皮肤黑色素异常沉积的分子机制。本项目不但对酉州乌羊种质资源的开发利用具有重要的指导意义，还可为人类的多种黑变病（melanosis），如皮肤黑变病、结肠黑变病、粘膜黑变病等的研究和治疗提供参考。

本项目首先通过对酉州乌羊X板角山羊资源家系的270个F1杂交后代的表型进行统计分析发现，酉州乌羊乌皮表型相对于白山羊为典型的显性遗传。随后，构建了含14722个SNP标记分布于31个连锁群体的总图距为2472.28 cM的山羊遗传图谱。为了鉴定乌皮性状的候选基因，一方面在自然群体（n=336）中对毛色、肤色、胡须、产仔数、肉冉等7个性状进行GWAS分析，在全基因组水平上鉴定到了与毛色显著关联的SNP 3个，胡须性状SNP 2个，产仔数与肉冉相关的SNP各1个，但未检测到与肤色显著关联的位点。随后，通过NGS技术构建了酉州乌羊参考基因组（size=2.83G; contig N50=94.53kb；scaffold N50=24.68Mb；含20905个编码基因），并进行了比较基因组和转录组综合分析，发现ASIP（agouti signaling protein）为乌皮性状的关键候选基因，且其基因结构较为复杂。通过构建基因组BAC文库并结合皮肤全长转录组测序（ONT）分析，确定了酉州乌羊ASIP基因组结构（74626bp）,明显大于参考基因组山羊的ASIP基因（20834bp）。同时发现，鉴定到的两个乌羊ASIP基因的特异性转录本ONT.6666.1和ONT.6327.1非编码外显子与已知乌皮哺乳动物的ASIP基因非编码外显子高度同源，暗示ASIP非编码外显子在黑色素细胞的组织定位方面可能发挥重要作用；变异分析发现，酉州乌羊ASIP 基因转录本ONT.6666.1的exon3(276处与355处）分别有20 bp和11bp的序列插入，导致蛋白翻译提前终止；转录本ONT.6327.1 的exon2 (426处)有2个碱基删除，导致蛋白翻译出现移码突变，而白山羊ASIP 的exon4（494处）删除1个碱基（C），导致从第89个氨基酸开始出现移码突变。对候选基因ASIP及其他色素生成关键基因进行了表达分析，揭示了这些关键基因与黑色素生成的关系以及在酉州乌羊乌皮性状形成过程中的作用。结果表明，ASIP基因特异性结构以及突变的双重作用，导致乌羊ASIP表达显著降低，减弱了对MC1R下游信号的抑制，促进了黑色素生成基因的表达。此外，我们还发掘了491649个SSR序列，在基因组与进化层面解析了酉州乌羊品种特性与群体遗传结构，山羊的驯化、选择及品种分化等。