NF-κB信号通路介导B细胞对鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗免疫应答的机制研究

Chicken infectious bursal disease ( IBD ) immune complexe is a new vaccine that can break through the maternal antibody interference, more safe and effective than conventional IBD live vaccine, but the mechanism of immune complexes how to activate B lymphocytes is still poorly understood. In present study, we intend to prepare IBD immune complex vaccine and vaccinate SPF chickens, in order to explore the mutual relationship between antibody dynamics and virus replication in peripheral B lymphocytes, IBD antibody levels in blood and the amount of virus in peripheral B lymphocytes at different time points was detected, Furthermore, to test and verify the B cell NF kappa B signaling pathway changes in B lymphocytes after vaccination, the signaling pathway change in tyrosine protein kinase (PTK) and tryptophan protein kinase (PCK) by luciferase reporter gene systems in B lymphocytes will be examined, NF kappa B DNA binding activity will be measured by chromatin immunoprecipitation assay, the nuclear translocation of NF kappa B and the changes of I-κB (α, β) will be detected by electrophoretic mobility shift assays, and the concentration of intracellular free Ca2+ will be measured by Ca2+ fluorescent probe. Finally, to confirm the biological effects of B lymphocytes after activation, the transformation proliferation and apoptosis of B lymphocytes will be detected, Real time RT-PCR and ELISA methods will be used to detect intracellular NF kappa B, MHCII and cytokines IL-6, IL-8, IL-10 mRNA transcription and protein expression respectively. This project aims to elucidate the mechanism of avian infectious bursal disease immune complex vaccine at the cellular and molecular level.

鸡传染性法氏囊病（IBD）免疫复合物疫苗是一种能突破母源抗体干扰的新型疫苗，但对该疫苗如何激活B细胞活性的作用机制研究还不清楚。本项目拟制备该疫苗免疫SPF鸡，研究免后不同时间抗体消长与B细胞内病毒量的互相关系；进一步应用荧光素酶报告基因检测B细胞内酪氨酸蛋白激酶及色氨酸蛋白激酶传导通路变化，染色质免疫共沉淀技术测定 NF-κB的DNA结合活性，电泳迁移率变化分析技术检测NF-κB核移位和I-κB（α，β）变化，Ca2+荧光探针测定胞内游离Ca2+浓度变化，确定疫苗免疫后B细胞内NF-κB信号通路变化；最后检测B细胞转化增殖、凋亡情况， Real time RT-PCR和ELISA方法分别检测胞内NF-κB、MHCII和细胞因子IL-6、IL-8、IL-10的mRNA转录和蛋白表达情况，确定B细胞激活后的生物学效应。本项目旨在从细胞和分子水平，阐明鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗的作用机理。

鸡传染性法氏囊病（IBD）是传染性法氏囊病毒引起的一种急性、高度传染性疾病， IBD免疫复合物疫苗是一种新型疫苗，但疫苗作用机制研究还不清楚。本项目研制出新型IBD免疫复合物疫苗，比常规活疫苗更为安全有效。用IBD免疫复合物疫苗和IBD活疫苗免疫1日龄SPF鸡，并对B细胞内病毒载量进行了测定，结果显示IBD活疫苗在免疫后7 天病毒载量最高，而IBD免疫复合物疫苗免疫后14 天病毒载量达到最高，在免疫后21 d⁓42天复合物疫苗组仍高于活疫苗组。为研究B细胞NF-κB信号通路变化，用激光共聚焦显微镜检测NF-κB核移位情况，试验证明IBD复合物疫苗能引起NF-κB 发生明显核移位，Ca2+浓度测定结果显示Ca2+浓度比对照组明显升高（P<0.05），同时也发现Ca2+抑制剂、PDTC可以抑制NF-κB信号通路。进一步检测B细胞增殖和凋亡情况，免后7天，相对于对照组，IBD免疫复合物疫苗刺激过的B细胞受LPS刺激后差异不显著（P＞0.05），但活苗刺激过的B细胞增殖明显下降（P＜0.05）；凋亡检测结果表明IBD免疫复合物疫苗引起外周血B细胞凋亡高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。T细胞和B细胞分析表明复合物疫苗组CD4+ T细胞、CD8+T细胞数量高于对照组，而Bu-1+ B细胞数量明显低于对照组，但高于活苗组。用Real time RT-PCR 和 ELISA法检测外周血中NF-κB等分子情况，结果表明NF-κB、MHC-II含量升高，而IL-6、IL-8、IL-10与对照组基本相同，分子mRNA相对表达量与血清中含量基本相同，而活苗组NF-κB、IL-6、IL-8、IL-10含量和mRNA相对表达量均明显高于对照组（P<0.01或P<0.05）。上述试验结果证明IBD免疫复合物疫苗激活NF-κB信号通路，从而有效地引发免疫应答，mRNA分子水平检测表明没有引起IL-6、IL-8等炎性因子上调，减轻了法氏囊损伤，降低了B细胞凋亡数量，保证了法氏囊不断补充成熟B细胞到外周循环免疫系统，初步阐明了免疫IBD免疫复合物疫苗的分子机制，为进一步的疫苗研发奠定基础。本研究发表了4篇中文核心期刊文章，一篇SCI审稿中，联合培养硕士研究生2名和在职博士1名，项目主持人晋升副研究员并获2个新项目，一名项目参与人晋升研究员。