纸芯片电化学界面的构建及其在肿瘤抑制基因甲基化研究中的应用

The methytation status of DNA is closely related to the formation and progression of cancer. The traditional methods for the analysis of tumor suppressor gene methylation are associated with high costs, time-consuming operations, or complicated instruments. In order to overcome these limitations, the construction of paper-based electrochemical interface is proposed for the investigation of tumor suppressor gene methylation. Based on inkjet printing and vacuum filtration techniques, the strategies for the construction of paper-based analytical devices are conceived. In order to improve the sensitivity for DNA methylation analysis, several efficient signal amplification techniques are presented, such as guanine-based signal amplification, supersandwich concatamer-based signal amplification, and Exo III-aided signal amplification. Based on the charge transport path of DNA coupled with target-induced conformational switching, the universal recognition of any methylation site is proposed. Taking advantage of paper-based nucleic acid array chips, simultaneous screening of the methylation statuses of multiple CpG sites is designed for the analysis of the promoter region of tumor suppressor gene. Finally, the assays of human methyltransferase activities from breast cancer cell (T47D) and healthy adjacent tissue are proposed for real-life sample analysis, which may make the presented project promising for potential applications in clinical diagnosis. The implementation of this proposal will provide a powerful tool for early disease diagnosis, drug screening, as well as insight into the fundamental mechanisms of genetic information.

DNA的甲基化状态与癌症的形成和发展过程密切相关，肿瘤抑制基因的甲基化检测有助于癌症的早期诊断。DNA甲基化的传统检测方法存在分析成本高、检测速度慢、仪器设备复杂等缺点。为解决这些问题，本项目拟开展纸芯片电化学界面的构建及其在肿瘤抑制基因甲基化检测中的应用研究。以纸芯片电极的制备为基础，建立DNA甲基化检测新方法，主要研究内容包括：基于喷墨打印和真空抽滤技术，建立纸芯片界面的构建方法；发展多种信号放大技术，并将其应用于肿瘤抑制基因甲基化的高灵敏检测；基于DNA的电荷传递路径和目标诱导的构象变化，建立任意甲基化位点的识别方法；制备核酸阵列芯片传感器，建立启动子区域中多个甲基化位点的同时检测技术；开展实际样品分析，考察乳腺癌细胞（T47D）中甲基转移酶的活性，探究甲基化检测在临床检验中的应用价值。本课题的研究将丰富临床诊断新技术，对疾病的早期诊断、药物筛选和遗传学的机理探究具有十分重要的意义。

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容，肿瘤抑制基因的甲基化检测为癌症的早期诊断提供了有效途径。传统的DNA甲基化检测法存在操作复杂、设备昂贵、检测速度慢、难以在落后地区普及等局限。为解决这些问题，本项目开展了纸芯片电化学界面的构建及其在肿瘤抑制基因甲基化检测中的应用研究。利用真空抽滤技术，以纸芯片为基底，设计组装功能化的石墨烯和金纳米粒子，建立了纸基电化学传感平台，实现了目标分子的电化学检测。为了提升分析参数和检测性能，本项目建立了基于核酸外切酶（Exo III）信号放大的DNA甲基化检测法；建立了基于目标诱导构象变化的DNA甲基化检测法；建立了基于“超级三明治”串联体信号放大的免标记检测法；并实现了肿瘤抑制基因序列中多个CpG位点的同时识别，探究了DNA甲基化的电化学检测在实际样品分析中的应用价值。在完成以上工作的基础上，基于胞嘧啶调控的电致化学发光共振能量转移体系，实现了HeLa细胞中miRNA-21的精准测定。基于正电性金纳米粒子对银纳米簇的荧光猝灭效应，实现了肺癌、乳腺癌和健康血样中miRNA-155的检测。本项目不仅构建了纸基电化学传感平台，发展了新颖的DNA甲基化和miRNA检测方法，而且显著改善了分析参数，拓宽了检测范围，并降低了检出限。本项目的研究结果可识别DNA序列中多个CpG位点的甲基化状态，并实现定量测定，其线性范围和检测限分别是10 fM−1 nM和450 aM；本项目可实现实际样品中miRNA-21的准确测定，其线性范围和检测限分别是1 fM−100 pM 和600 aM。与文献的方法相比，均有了显著的改善。本课题的研究丰富了电化学界面构建方法和新型临床检验技术，对基础电化学、疾病的早期诊断、药物筛选和表观遗传学的机理探究具有十分重要的理论意义和实用价值。