高效好氧反硝化耐冷菌的分离鉴定及其冷适应分子机理研究

近年来我国一些主要湖库频繁发生蓝藻爆发现象，并有向北方蔓延的趋势，成为急需解决的环境问题。要从根本上治理富营养化水体，必须解决低温期水体中营养盐的积累问题，但目前主要是研究水华爆发期植物和微生物对水体中营养盐的转化与固定，忽视了耐冷菌在富营养化水体修复中所起的重要作用。好氧反硝化细菌由于对溶解氧水平和温度条件具有高度的适应能力，在富营养化水体治理方面正引起人们的密切关注，但缺乏低温应用方面的理论研究。因此本研究以低温富氮水体为修复对象，分离鉴定高效的好氧反硝化耐冷菌，并利用荧光定量PCR微阵列筛选菌株抗寒的关键冷休克蛋白基因和克隆好氧反硝化关键酶基因及对其结构进行预测，从分子水平揭示菌株的抗寒和低温好氧反硝化的生化机制和遗传特征；同时研究耐冷菌好氧反硝化的限制性因子和主要环境因子之间的联合作用机制，为高效基因工程菌的构建和从基因水平对好氧反硝化耐冷菌的微生态调控提供理论依据和技术支持。

本课题组首先通过低温定向驯化培养从寒区水体中分离获得耐冷好氧反硝化菌株，然后从中筛选出高效的“一菌多能”菌株，并系统了研究该菌株在纯培养和/或环境样品培养下碳源、营养水平、碳氮比、电子受体、溶解氧水平、温度、pH、盐度、重金属、抗生素、农药等生态环境因子对菌株低温生长和氮磷代谢的单一和/或联合作用规律。同时，利用qPCR、SDS-PAGE、蛋白质谱分析、Western blot等分子生物学技术研究冷诱导条件下该菌中所有冷休克蛋白家族基因的表达水平差异，进而筛选出冷适应关键基因，然后采用质粒转化技术进一步研究该关键基因编码的冷休克蛋白的功能和特性；并克隆和测序了该菌的好氧反硝化酶基因。最后模拟研究了菌株对富氮磷水体及农田径流污染水体中氮磷和有机物的去除规律。结果表明，从低温水体中分离获得的耐冷菌DBP-3在低温（5℃）下仍然保持较高的生长和代谢活性，适宜生长的温度范围为10-30℃。系统发育和生理生化特征表明其属于不动杆菌属，与约氏不动杆菌的亲缘关系最近。菌株DBP-3不仅具有好氧反硝化功能，同时还具有异养硝化和好氧聚磷功能，并且在低营养水平和碳氮比下亦可良好生长和代谢氮磷。生态环境因子影响研究表明，溶解氧水平在菌株的生长和代谢过程起着关键作用，影响着菌株的生长水平、代谢过程和对不利因子的抗性；菌株优先利用乙酸钠进行生长和代谢氮磷；菌株对Hg2+和利福平敏感，对As3+和先锋霉素的耐性很强；抗生素和重金属可对菌株产生协同毒性作用。建立了约氏不动杆菌的本地基因组库和蛋白质组库，并对冷休克蛋白家族特有的高度保守区域进行了比对，共在约氏不动杆菌的基因组中查找到7种Csp基因，获得了关键的冷休克蛋白（Csp3和Csp4）及其编码基因.将构建的Csp3 和Csp4的表达载体转入大肠杆菌后的低温生长实验表明可明显增强大肠杆菌在低温下的生长能力。克隆出了菌株DBP-3的关键适冷好氧反硝化酶编码基因（napB），其大小为450 bp，系统发育表明其与Escherichia coli的同源性最高。模拟研究表明，在农田径流污染水体和富氮磷水体中，菌株在低温下（10℃）下可占据优势生态位，能够明显降低富营养化水体上覆水中的氮磷含量，进而加快底泥中的氮磷释放，有利于减少低温富营养化水体的内源负荷。本研究为寒区富营养化水体的根治提供了新思路。