转录因子Foxp1/2/4在中脑多巴胺能神经元发育过程中的作用及机制研究

Midbrain dopaminergic neurons are the key cells associated with many important neurological and mental disorders, such as Parkinson’s disease (PD). Development of mDA neurons is dynamically controlled by a lot of transcription factors. Our previous studies and others at home and abroad have shown that Foxp1/2/4 transcription factors of Foxp subfamily are conserved and play cooperative roles in the development of many tissuses. However, the functions and mechanisms of Foxp1/2/4 in the development of mDA neurons are still unclear. In our earlier studies, we foud that Foxp1/2/4 express in the ventral midbrain of embryo, and over-expression of Foxp1/2/4 in vitro could regulate the differentiation of mDA neurons. So we aim to research the functions and mechanisms of Foxp1/2/4 penetratingly in the development of mDA neurons: First, we will clarify the expression patterns of Foxp1/2/4 during multiple phases of mDA neuron development and comfirm the types of the cells expressing Foxp1/2/4 by immunofluorescence assay. And then, we will verify the roles and the cooperation of Foxp1/2/4 in the processes of specification and differentiation of mDA neurons using Foxp conditional knock-out mice which are single or double deficiency of Foxp1/2/4 genes by Nestin-cre in vivo and cell overexpression and knockdown experiments in vitro. Finally, we will analyse the mechanisms of Foxp1/2/4 in the development of mDA neurons by ChIP-Seq, luciferase report assay, IP and other methods. In conclusion, this study would show new insights into the mechanisms of transcriptional regulation in the development of mDA neurons, and also provide important theoretical foundation for the therapy of some mental and neurological disorders.

中脑多巴胺能（mDA）神经元是帕金森病等神经精神疾病发病的关键细胞，其发育受到许多转录因子调控。Foxp转录因子家族中Foxp1/2/4高度保守，协同调节着多种组织和器官的发育，但Foxp1/2/4在mDA神经元发育中的功能和机制尚未阐明。课题组前期研究表明Foxp1/2/4在发育早期的中脑腹侧表达，其体外过表达亦调节着mDA神经元的分化。因此，本项目拟通过免疫荧光技术阐明Foxp1/2/4在mDA神经元发育中不同时期的表达及其表达的细胞类型；利用Foxp1/2/4条件性单敲或双敲小鼠模型和细胞实验，从体内外研究Foxp1/2/4在mDA神经元命运决定、分化等过程中的功能，以及其成员之间的协同作用；结合ChIP-Seq、免疫沉淀、荧光素酶报告等技术分析Foxp1/2/4的作用机制。该研究结果不仅将进一步揭示mDA神经元发育的分子调控机理，也将为相关神经精神疾病的治疗提供理论基础。

中脑多巴胺神经元是中枢神经系统中产生多巴胺类递质的主要神经元，与帕金森病等神经精神疾病发病密切相关，因此，本项目主要探讨转录因子Foxp1/2/4在中脑多巴胺神经元发育中的作用。首先，通过表达谱分析确立了转录因子Foxp1/4在中脑多巴胺神经元发育不同时期的表达及其表达的细胞类型，但是Foxp2在发育早期的中脑腹侧并无特异性表达，推测Foxp1/4可能参与了多巴胺神经元早期发育；然后本项目利用体外过表达实验进行验证，发现Foxp1/4调节着多巴胺神元分化相关因子的表达，因此，我们进一步构建了Foxp1/4条件敲除小鼠进行体内研究，结果显示敲除小鼠中脑多巴胺神经元减少，并且其成年小鼠的行为学异常，其中，Foxp1可调节胚胎发育早期多巴胺神经的前体细胞的增殖和分化，从而影响中脑腹侧的多巴胺神经元的发育。为此，我们重点对Foxp1的调节机制进行探索，通过对Foxp1敲除小鼠和对照小鼠胚胎发育早期的中脑进行RNA-seq分析，结果检测到与神经元命运分化等相关的383个基因的表达异常，其中166个基因表达上调、217个基因表达下调，结合定量PCR和CHIP-seq等方法预测到参与多巴胺神经元分化相关的因子Foxa1、Foxa2、Gli3、Pix1等基因可能是其下游调节的靶基因，但是仍需进一步的荧光素酶报告实验、回救实验等验证。另外，神经干细胞移植作为神经退行性疾病和脑损伤的有效治疗途径之一，并且我们在神经干细胞中检测到Foxp1/4的表达，本项目对转录因子Foxp1/4在神经干细胞分化中的作用也进行了初步探索。我们构建了神经干细胞体外培养和诱导分化平台，然后利用体内外过表达或敲除实验发现其可调节神经干细胞向神经元方向分化。综合上述研究结果，本研究拓展了中脑多巴胺神经元发育相关的转录调控机理，并有望为帕金森等相关的神经精神疾病的发病机制和治疗提供一定的理论依据。