异源small RNA调控芸薹属蔬菜遗传变异发生的分子机制研究

Small RNA as a kind of key regulators play an important role in diverse aspects of plant development. In previous studies, the resules showed that small RNAs can exchange between heterologous cells, and regulate the expression level of genes in receptor. So we conjectured that the exchanges of heterologous small RNAs(different species)and its effection for the receptor is one of the important reasons for inheritable variation occurred in distant hybridization. Here we use the asexual and sexual progenies as experimental materials obtained from the distant hybridization in Brassica vegetables(Brassica juncea and Brassica oleracea ) and through the qRT-PCR、MSAP and transgenic technology to testify our hypothesis, and clarify the relationship of heterologous small RNAs-gene-morphological variation and define the molecular mechanism of inheritable variation regulated by heterologous small RNA through test the differential expression of small RNA and genes related characters variation, as well as analysis of methylation patterns between variant plants and control. The research will provides new methods for studying variation mechanisms induced by distant hybridization.

Small RNA是植物生长发育的一类重要调控因子。先期研究表明：small RNA可以在异源细胞之间移动与交流，并对受体的相关基因进行调控。因此我们推测，异源small RNA（不同种、属间）的移动与交流及其对受体基因的调控作用是远缘杂交中发生遗传变异的重要原因之一。本项目以芸薹属蔬菜（主要以榨菜与紫甘蓝为材料）的远缘无性与有性杂交为实验体系，利用qRT-PCR、MSAP、转基因等技术手段，进行异源small RNA的特异或差异表达、以及与性状变异相关基因的差异表达，甲基化模式分析及变异性状相关基因功能验证研究，阐明异源small RNA-基因-遗传变异之间的关系，明确异源small RNA诱导遗传变异的作用机制与模式，为农作物遗传改良和新种质的创制提供崭新的理论依据与途径。

项目针对以下科学问题：即异源small RNA是否在受体植株内与其自身small RNA共同调控了植物生长发育，异源small RNA的调控作用是否会影响到受体的有性杂交以及无性杂交的后代的遗传变异，以及遗传变异发生的规律与机制是什么开展了研究。以芸薹属蔬菜（榨菜和紫甘蓝的远缘嫁接，白菜和黑芥的有性杂交）为实验材料体系。开展了不同杂交方式中异源small RNA 特异或差异表达分析、以及与性状变异相关基因的表达的相关性研究。主要结果为:(1)异源small RNA可以在嫁接细胞之间转移，并引起受体细胞small RNA种类与数量发生改变， 并且这种改变可以在有性与无性世代中得到维持。(2)small RNA的种类与数量发生改变调控了受体细胞的基因的表达，并且基因表达的变化可以遗传到下一代。关键的数据有:(1)首次通过原位杂交技术鉴定茎尖分生组织细胞层组成。(2)通过small RNA测序在嵌合体的榨菜回复系植株中检测到了紫甘蓝谱系特异的small RNA。榨菜回复系与亲本相比具有24.29%的差异small RNA类型，而这部分差异的small RNA与紫甘蓝具有0.60%的相关性，大约包括97342条sRNA，它们很可能是在榨菜与紫甘蓝细胞间谱系发生交流的small RNA。(3)以嵌合体TTC自交第三代GS3为研究材料，进行了转录组及表达谱研究。与榨菜相比较，GS3有1187条基因显著性差异表达，其中676个基因上调表达，511个基因下调表达，这些差异基因参与众多的生物学过程。其中筛选到了2个与叶形相关的候选基因（ARP、CKO）。这一结果表明了嫁接诱导的叶形变异性状的产生与基因表达改变具有相关性。另外，在白菜与黑芥有性杂交中发现杂交后代的miRNAs表达水平与亲本相比较都呈现上升趋势，其siRNAs表达水平比白菜相比呈上升趋势，而与黑芥相比呈下降趋势。随着倍性水平的提高，miRNAs比例增大，而siRNAs的比例减小。从亲本、杂交种、多倍体中一共得到320个已知miRNAs和52个新miRNAs。并且通过qRT PCR分析发现，目标基因的表达水平与miRNAs表达呈负相关。本项目的研究明确了异源small RNA移动与交流及其对受体基因的调控作用是远缘嫁接与杂交中发生遗传变异的重要原因之一。研究结果为农作物通过“获得性”进行遗传改良提供崭新的理论依据。