用二维黑磷/纳米金复合材料检测外泌体多重癌症标志物的研究

Cancer is a serious threat to human health and one of the leading causes of death. The occurrence and development of cancer is associated with DNA at the genetic level, RNA at the transcriptional level and proteins at the functional level. It is urgent to develop a platform to detect multilevel biomarkers for early-stage cancer diagnosis. The exosomes secreted by cancer cells contain DNA, RNA, and over-expressed specific proteins etc, which show great potential for early diagnosis and monitoring of cancer. In this project, two dimensional black phosphorus (BP) /gold nanoparticles (GNPs) composite is used to construct a colorimetric sensing platform to detect multiple cancer markers carried by the exosomes. The biomarkers of non-small cell lung cancer including EGFR gene mutation, EGFR mRNA and CFYRA21-1 protein are the detection molecules. Signal probes are immobilized on GNPs of the BP surface. The target molecules bind the signal probes on the BP sheet and the capture probes-labeled plate to form a sandwich structure. BP/GNPs composite catalyzes the reduction of 4-nitrophenol to generate amplified colorimetric signals. This method provides a simple and quick tool to realize visual multiple cancer biomarkers detection in the exosomes, which opens a new path for the early diagnosis of lung cancer.

癌症严重威胁人类健康、是导致死亡的主要原因之一。癌症的发生和发展与基因水平的DNA、转录水平的RNA和功能水平的蛋白质密切相关。开发一种可用于多水平生物标志物检测的癌症早期诊断平台迫在眉睫。肿瘤细胞产生的外泌体含有DNA、RNA、过度表达的特异性蛋白等成分，对癌症的早期诊断和监测展现出巨大的潜能。本项目用二维黑磷/纳米金复合材料构建一种比色传感平台，可以对外泌体所携带的多重癌症标志物进行快速检测。项目以非小细胞肺癌的标志物EGFR基因突变、EGFR mRNA以及细胞角蛋白片段为检测对象，在二维黑磷负载的纳米金上结合信号探针，目标分子与连接在二维黑磷上的信号探针以及固定在酶标板上的捕获探针共同形成三明治结构，通过二维黑磷/纳米金对硝基苯酚还原反应的催化作用和对检测信号的放大功能，实现外泌体多重癌症标志物的可视化检测，为肺癌的早期诊断提供一种简单快捷的新工具。

癌症严重威胁人类健康，给患者带来巨大痛苦。外泌体和循环肿瘤细胞是癌症早期诊断的重要标志物，对于早期发现癌症、早期治疗、降低患者死亡率具有重要意义。由于比色生物传感器操作容易、响应快速，而且可重现性好、成本低廉，因此本项目构建了不同类型的比色传感器。黑磷具有可调节的带隙、合适的载流子迁移率和开/关比和良好的生物相容性，在光电领域和生物医学领域得到广泛应用。然而黑磷在氧气/水环境下会快速降解，因此我们采用缺电子的金属离子与黑磷表面的磷原子相互作用，降低黑磷表面的磷原子的电子云密度，从而降低黑磷的反应活性，达到稳定黑磷的目的。我们比较了贵金属离子、重金属离子和轻金属离子与黑磷的相互作用，发现贵金属离子加速黑磷的降解，重金属和大部分轻金属离子对黑磷稳定性提高不明显，Al3+稳定黑磷的效果最好，但也只能使黑磷在两周内保持稳定。我们利用黑磷-纳米金复合材料（BP/Au）催化4-硝基苯酚（4-NP）的还原，人宫颈癌HeLa细胞与黑磷-纳米金表面的叶酸相互作用而掩盖住催化位点（纳米金），使其催化4-NP的速率明显下降。用叶酸修饰的黑磷-纳米金比色传感器能够区分叶酸受体阳性的HeLa细胞和叶酸阴性的A549细胞，但最低检测限只能达到105 cell/mL。. 由于黑磷-纳米金比色传感器灵敏度有限，而且不稳定，难以长时间储存，BP/Au使用前需要新鲜制备，因此我们采用一种物理化学性质非常稳定的天然材料孢粉素作为纳米金的基底。我们在孢粉素微囊上原位负载纳米金，显著提高了纳米金的稳定性和分散性，同时减少了蛋白质的非特异性吸附。用CD63适配体修饰的孢粉素-纳米金无标记比色传感器检测人肺癌细胞A549来源的外泌体，最低检测限达到10 particles/μL, 线性范围为10-108 particles/μL，是一种高度灵敏和特异的检测方法，具有良好的生物医学应用前景。