肝特异性表达凝血因子Ⅷ基因治疗A型血友病的实验研究

Hemophilia A is a serious threat to human health, and the recombinantly expressed coagulation factor VIII is the major choice of treatment. In terms of the fact that life-long, repeated injections are required for the patients, and thus, gene therapy may benefit patients the most. However, the current progress made in this area is little due to a lower expression of that clotting factor by traditional methods. Based on our preliminary studies, some important, liver-specificly expressed genetic components were cloned to build a liver-specific expression vector, and the cell lines are transfected by the vector, expression a high level of coagulation factor VIII, and selected. Furthermore, the regulatory mechanisms of coagulation factor VIII expression in vivo will be explored to obtain some positive or negative regulation proteins, the adenovirus vector will be made to produce higher expression of the clotting factor VIII, and the cell lines and animal model will be used to investigate the value of clotting factor VIII expression. This study will not only be helpful for the production of coagulation factor VIII by biomedical engineering, lower prices and better quality of recombinant proteins, but also provide a theoretical and practical basis for hemophilia A gene therapy.

A型血友病严重威胁人类健康，重组表达凝血因子Ⅷ是目前治疗该病的主要手段，但因其需反复注射、终身用药、不能根治等缺点，基因治疗成为研究热点。研究表明，传统的基因治疗方法在体内表达凝血因子Ⅷ受到多种调控机制的影响，表达水平很低，不能满足治疗需要。本研究拟在前期的研究基础上，首先通过改造凝血因子Ⅷ的基因，克隆肝特异性高表达元件来构建肝特异性表达载体，筛选得到稳定高表达凝血因子Ⅷ的细胞株；并研究细胞内影响凝血因子Ⅷ表达的调控机制，筛选并鉴定具有正负调控效应的相互作用蛋白。构建正、负调控蛋白腺病毒载体，在细胞及动物模型中验证其对提高肝特异性腺病毒载体表达凝血因子Ⅷ的功效，探讨其对A型血友病的基因治疗价值。该研究不仅有益于凝血因子Ⅷ的基因工程生产，获得质优价廉的重组蛋白，还可为A型血友病的基因治疗提供理论基础与实践依据。

A型血友病是严重威胁人类健康的重要疾病之一，迄今没有满意的治疗方法。目前国内对该病的治疗仍以血浆凝血因子Ⅷ浓缩剂为主。重组凝血因子Ⅷ已经被FDA批准应用于临床，但不能够从根本上治疗血友病，并且患者体内易产生抗凝血因子Ⅷ的抗体。为有效推进以重组凝血因子Ⅷ为基础的基因治疗走向临床应用，本研究在前期研究的基础上对凝血因子Ⅷ的体内外的表达体系进行改进，通过提高表达体系的靶向性及表达效率，为凝血因子的体外基因工程生产和体内基因治疗Ａ型血友病提供新的思路。.本研究在前期研究的基础上，本研究选用AFP增强子和albumin 启动子，采用慢病毒为表达载体，成功构建了肝特异性高效表达凝血因子Ⅷ慢病毒载体；并对表达的凝血因子Ⅷ进行了体内、外功能研究。并尝试对凝血因子Ⅷ相互作用蛋白进行捕获进而进行鉴定。.我们成功的构建了带有AFP增强子，albumin启动子以及neo筛选基因和VIII因子的病毒表达载体，在此基础上我们成功包装了高滴度的慢病毒。在体外转染实验中，我们首先证实带有AFP增强子和albumin启动子的VIII因子表达载体可以特异性的在肝脏细胞中高表达。此外，我们进一步验证了所构建的慢病毒能否在小鼠体内肝脏特异性的高表达。在注射病毒后20天血清中的VIII因子达到3.8ug/ml，并且持续高水平表达，在注射后100天时，血清中VIII因子含量仍然高达500ng/ml。载体表达的VIII因子的功能研究证实，注射病毒载体后10天血清中VIII因子的凝血活性可达到0.85U/ml,并且可以持续至100天，凝血活性仍可以达到0.3U/ml。.以上实验完全验证我们所新构建的慢病毒能够在体内特异性高表达，且能维持较长时间和较高的水平。所表达的VIII因子具有很好的凝血活性。此可以为凝血VIII因子的工程生产提供借鉴还为Ａ型血友病的基因治疗提供理论与实践基础。