基于S-糖蛋白与钙依赖蛋白的茶树自交不亲和机理研究

以研究茶树花柱中S糖蛋白提取、分离和纯化的技术，得到具RNase活性的S糖蛋白为基础，进行S糖蛋白的N-端氨基酸测序，据此克隆S糖蛋白基因；研究S糖蛋白的等电点、对酵母RNA的比活性等生化特性；根据茶树雌蕊S糖蛋白在花柱不同部位、不同时期的时空分布对花粉萌发及花粉管生长的影响，探明茶树雌蕊S糖蛋白与自交不亲和性[SI]之间的作用机制；提取供试茶树品种花柱的mRNA，采用RT-PCR、RACE等克隆编码茶树其它SI基因，通过形态学指标和SI基因的Northern、QPCR结果验证各相关基因在茶树自交不亲和中的作用；研究钙依赖蛋白在授粉过程中作用，了解其与S糖蛋白活性和自交不亲和性的相关性。茶树SI基因时空表达特性是准确理解茶树SI的遗传机理的基础，本项目所进行的基础性工作对阐述茶树繁殖生物学的科学意义是非常必要的，对指导茶树杂交育种和远缘杂交育种，促进茶树遗传改良具有重要的指导意义。

项目根据茶树的生殖特点，对茶树的自交不亲和进行了较为深入的研究。主要研究了茶树在花期花粉的萌发过程、从茶树花粉的体外保存与萌发条件、茶树花粉管在自交和杂交后在花柱及在子房内的生长与受阻情况、茶树自交后与杂交后基因的表达差异以及茶树自交后与杂交后蛋白质组学的差异研究，研究表明，杂交与自交的花粉在授粉48h大多数花粉管均穿过花柱进入子房组织；但杂交的茶树花粉管能顺利进入子房，自交的花粉管则不能进入，仅停留在子房腔内。说明茶树的自交不亲和可能与原先设想的配子体自交不亲和机理不同，可能属于延迟型自交不亲和（LSI）或子房自交不亲和（OSI）。在自交不亲和发生过程中，通过cDNA-AFLP技术共找出已知并可能与自交不亲和相关的基因序列15条，其中与自交授粉相关或信号传导相关较为密切的有钙依赖型蛋白激酶，衰老相关蛋白，G蛋白和细胞周期蛋白等。通过对7条内参基因（GAPDH、EF-1α、18S rRNA、TUA1、TUA2、ACT、UBI）的保守性与表达稳定性的研究选择GAPDH作为内参基因考察了授粉后与自交不亲和相关的基因表达，发现CsiCDPK基因在茶树自花授粉后特异表达，而在异花授粉和未授粉的子房内以及在叶片中均无表达。提示CsiCDPK基因可能在茶树自交不亲和过程中发挥重要的作用。在茶树自交与杂交后的蛋白质组学的研究中，通过双向电泳可以分离得到约900个蛋白点，经差异分析和质谱检测鉴定出59个差异蛋白点，这些蛋白参与代谢、蛋白去向、细胞骨架、贮藏、运输、胁迫和花粉识别过程。自花授粉激发更多的ROS，24h时，各种代谢活跃，蛋白合成量增加，但是在授粉后72h时这些过程却较异花授粉弱，一种花粉识别蛋白在自交授粉后72h后特异表达，可能在茶树自交不亲和中发挥重要作用，研究发现授粉后72h是茶树自交不亲和发生的一个关键时期。项目至今已发表（在线）文章4篇，其中SCI收录3篇，另有2篇文章（英文）正在投稿和撰写中，拟投Analytical Biochemistry和Journal of Proteomics.