以CD4为靶点的新型眼用凝胶（J2）抗角膜移植排斥的实验研究

移植排斥反应是角膜移植手术失败的首要原因，目前抑制角膜移植排斥的方法仍以药物为主，传统免疫抑制剂在特异性、有效性、毒副作用和经济性方面存在明显缺陷，开发新型高效、特异、低毒、价廉的免疫抑制剂, 是移植免疫研究的现实策略和发展趋势。角膜移植免疫中，T细胞的CD4分子和MHCⅡ抗原的相互作用是产生排斥反应的关键环节。针对以往药物的诸多不足,本课题拟通过计算机辅助药物设计技术，一种目前药物化学领域中新兴和高效的药物设计手段，通过活性位点分析、数据库搜寻和全新药物设计, 以CD4分子与MHCⅡ类分子复合结合物功能域为靶，获得拮抗CD4/ MHCⅡ复合物的小分子化合物J2的局部眼用凝胶，利用泪液pH值为中性(pH 7.2～7.4)的生理特征，为J2设计基于pH敏感的在位形成眼用凝胶系统，并建立动物模型研究其抗角膜移植排斥反应的效果，及进一步探讨其作用机理。

移植排斥反应是角膜移植手术失败的首要原因，其治疗仍以药物为主。针对传统免疫抑制剂在特异性、有效性、毒副作用和价格方面存在的缺陷，我们利用计算机辅助药物设计方法，以CD4分子与MHCⅡ类分子复合结合物功能域为靶，获得小分子化合物J2，特异性地抑制细胞免疫，具有新型、高效、特异、低毒、价廉的特点。本实验通过MTT法检测J2对原代培养的大鼠角膜上皮细胞和内皮细胞的毒性作用，结果见J2对角膜细胞的抑制作用非时间和剂量依赖性，电镜下10mmol/L J2对角膜上皮和内皮细胞产生毒性作用，细胞肿胀、胞膜出现裂孔。流式细胞分析技术检测J2作用后角膜上皮和内皮细胞表面CD80分子的表达，可见CD80明显降低。原子力显微镜观测J2对两种细胞胞膜表面超微结构的影响,药物组与对照组Ra,Rq,Rvm,Rt值有显著性差异。细胞毒性检测为进一步药物制备提供实验依据。在增加药物溶解性方面我们进行了一系列探索，将J2制备成适宜眼部给药的两种缓释剂型-海藻酸钠微球（Sodium alginate microspheres,SAM）和纳米混悬液（nano-suspension,NS）。光学显微镜观察J2-SAM的形态及大小，激光粒度扫描仪测量J2-NS的粒径，高效液相色谱法测定J2-SAM和J2-NS的载药量以及在体内、外的药代动力学行为。可见J2-SAM和J2-NS粒径均匀是良好的药物载体，体外有良好的缓释效应；结膜下单次注射J2-SAM和J2-NS可以在眼部缓慢均匀的释放，长期维持稳定的药物浓度，两者药代动力学参数无显著性差异，但J2-NS较J2-SAM更方便注药和更易控制给药剂量。建立大鼠角膜移植模型， J2-NS结膜下注射有抗大鼠角膜移植排斥作用，效果与CsA相似，可以减轻角膜移植术后角膜植片和同侧颌下淋巴结的细胞增生，抑制免疫应答。流式细胞仪检测外周血中T细胞亚群分布情况，可见当异体角膜移植排斥反应发生时，外周血中T淋巴细胞明显增多，J2可通过抑制T淋巴细胞增生，继而抑制其介导的角膜移植排斥反应，验证了J2设计的药物机理。Draize兔眼刺激实验证实J2-NS对眼表无刺激作用。通过研究，我们获得的J2-NS制备工艺稳定、简便，质量可控，符合国际通用眼用制剂的粒径要求，整个研究为J2成为我国具有自主知识产权的新型免疫抑制剂提供实验依据。