铁皮石斛多糖含量遗传规律与种质改良研究

Dendrobium officinale Kimura et Migo, used as a rare and valuable traditional Chinese medicine herbs for centries, has been planted　widely in recent years, with a total value of near ten billion yuan in China. The contents of polysaccharid which is the main active ingredient in Dendrobium officinale based on　《Pharmacopoeia of the People's Republic of China》, vary signilicantly in the products from different regions and even from different　planter in the same regions. In order to clarify the mechanism of the diversity in polysaccharides content in Dendrobium officinale, this project will investigate the following: (1) analyse genetic diversity of Dendrobium officinale using flow cytometry and molecular markers, and dynamically detect the polysaccharide content of both the different germplasm cultivated at the same place and the same germplasm cultivated but at different regions, which verifies the level of the genetic diversity of the Dendrobium officinale germplasm resources and then elucidates the interactions between polysaccharide accumulation and genetic background　and environmental factors; (2) analyse　the polysaccharide contents of the parents and the hybrid offspring derived from the parents with different polysaccharide content, which helps verify the genetic Variation of polysaccharide content, and then select the new germplasm with top quality from the hybrid offspring derived from the good parents; and (3）clone and analyse the genes of mannosyltransferase　and glucosyl transferase etc. that reglate polysacchride content using the homology cloning technology, which verifies the molecular mechanism of polysaccharide accumulation The project expects to purpose the theoretical basis for the resource utilization and germplasm improvement of Dendrobium officinale through above-mentioned studies.

铁皮石斛是传统名贵珍稀中药材，目前人工种植发展很快，在全国已形成近百亿元的产业。依据《中国人民共和国药典》，铁皮石斛多糖是铁皮石斛的主要药效成份，但目前不同地域、乃至同一地域不同种植者种出的产品多糖含量差别很大。为了明确其多糖含量的变化规律，本项目拟在开展以下研究：①利用流式细胞术和分子标记等技术进行遗传多样性分析，并动态检测同一地方种植的不同种质及不同地方种植的同一种质的铁皮石斛多糖含量，探明其铁皮石斛多糖含量变化与遗传背景及环境因子的关系；②利用铁皮石斛多糖含量不同的种质为亲本进行杂交，对亲本和杂交后代F1中的铁皮石斛多糖含量进行检测分析，明确其铁皮石斛多糖含量的遗传规律；并从杂交后代中筛选出优良种质；③采用同源基因克隆技术，克隆分析控制铁皮石斛多糖形成的甘露糖转移酶和葡葡糖基转移酶等基因，阐明铁皮石斛多糖积累的分子机理；通过上述研究，为铁皮石斛资源高效合理利用和种质改良提供理论指导。

铁皮石斛多糖是铁皮石斛的主要药效成份，为了深入探讨铁皮石斛多糖代谢调控规律，利用高通量测序技术建立了铁皮石斛转录组数据库。经拼接得到67396条的unigenes，并通过NR、SwissPort、KEGG、COG和GO在线数据库对这些unigenes进行注释。有1075条unigenes与Carbohydrate-Active有关，其中，有424条为糖基转移酶基因。根据铁皮石斛茎段多糖含量的变化规律，选取4个阶段的茎段进行表达谱测序，建立铁皮石斛多糖代谢基因库。根据基因注释和在这4个阶段的表达水平，筛选并克隆到8个甘露聚糖合酶基因。这8个基因属于CSLA family的成员，具有CSLA family的保守域。无论是组培苗还是成年苗都主要在茎中特异性表达。.磷酸甘露糖酶（Phosphomannomutase）催化甘露糖六磷酸（Mannose-6P）转变成甘露糖一磷酸（Mannose-1P）为合成GDP-D-Mannose提供前体。本研究首次从铁皮石斛中克隆到了该基因(命名为DoPMM)。DoPMM是HAD superfamily的成员，具有该家族的保守域及的PMM family成员的保守motifs。亚细胞定位发现DoPMM定位在细胞质中。.体细胞胚胎发生是铁皮石斛的重要再生途径之一，本项目克隆了铁皮石斛体细胞胚胎发生的类受体激酶（somatic embryogenesis receptor kinase）基因DoSERK的全长cDNA，该基因与其他植物的SERK高度同源，编码一个含633个氨基酸的蛋白质，生物信息学分析表明，该蛋白为亲水蛋白、具信号肽和跨膜区，可能定位于质膜，属于典型的SERK蛋白家族成员之一。系统进化树分析表明，DoSERK与小米（Setaria italica）的SERK蛋白亲缘关系最近。.对所收集到的种质资源的遗传多样性进行分析，并对它们的多糖含量进行了测定，发现不同资源多糖含量明显不同；根据多糖含量的不同，我们将所收集到的资源进行了分类；另外我们还发现不同地方种植的铁皮石斛的多糖含量也会不同；对原已筛选出的较高多糖含量的种质进行杂交，在果实成熟时进行了无菌播种，目前已繁殖出一定数量的种苗，并准备开展下一步的试验。.选育出的中科从都2铁皮石斛新品种通过了广东省的品种鉴定。.研究果为深入探讨铁皮石斛多糖积累规律及其调控机制打下了基础。