一种分泌型耐高温双功能酶的催化活性分子机制及其在沙雷氏菌中生理功能的研究

本实验室从中药白术中分离到一株沙雷氏菌FS14，该菌可以在胞外产生一种耐高温的兼有蛋白酶和核酸酶活性的双功能酶。这种耐高温的双功能酶从未见报道过，是一种全新的蛋白。本项目拟运用生物化学、分子生物学、生物信息学及分子遗传学等方法，克隆得到其编码基因，并通过活性相关位点的分析，分别将野生型基因和与功能相关位点的突变体基因在大肠杆菌中进行异源表达，并进一步对其表达产物进行功能验证及特性研究，从而明确该酶蛋白活性作用的分子结构基础及其机制；最后通过构建编码该蛋白的基因缺失菌株，进行生物学功能及特性研究，从而确定该蛋白在该菌生命活动中的具体生理生化功能。该研究将能扩展我们对蛋白酶和核酸酶的认识，为蛋白质的分子进化与功能进化提供新的科学依据，并可能为以应用为导向的耐高温蛋白酶的研究及蛋白酶的分子改造和功能重构提供一条新的可行途径。

本研究分离纯化及体外表达了沙雷氏菌FS14分泌的SP蛋白，证实该蛋白是一种具有独特热稳定性的，具有蛋白酶和DNA酶活性的双功能酶。本研究还解析了直接从培养液上清中纯化的SP蛋白的晶体结构，确认其为蛋白酶，且回收的晶体蛋白的确具有DNA酶活性。为了能够确认该蛋白的双功能特性，我们分别对该蛋白的编码基因和沙雷氏菌的核酸酶的编码基因nucA进行了缺失突变，并获得了它们的突变株。对突变体的研究结果显示，FS14的确能分泌胞外耐热DNA酶，但可能不止一个；我们纯化了SP 蛋白基因突变株中具有DNA酶活性的蛋白，发现其也同时均有蛋白酶和DNA酶活性；其质谱分析结果并结合我们与其他实验室合作测定的FS14菌株的基因组序列，确认FS14中还有三个与该SP蛋白有较高同源性的蛋白，我们分别将它们命名为SPA、SPB和SPC；对FS14中SP家族的这三个蛋白进行了体外重组表达和活性测定的结果也显示，它们均为双功能酶。此外，我们构建了30几个SP蛋白突变体蛋白，对它们的DNA酶活性位点进行了研究，结果显示，蛋白酶活性位点与DNA酶活性位点无关。为了最终能证明FS14菌株胞外的耐高温DNA酶活性的确来自于SP蛋白家族，以及确定DNA酶的活性位点，我们必须要将该菌所具有的共四个SP蛋白完全敲除。但是由于FS14具有多重耐药性，其它同属菌的遗传操作体系在该菌中不能够应用，因此为了构建该四重突变株，我们从头构建了用于突变的载体，并应用该载体进行了体内突变的研究。目前，我们已获得SP蛋白和SPB基因的双基因缺失突变株，正在构建三基因缺失突变株和四个基因全部缺失的突变株。四个SP蛋白酶基因全部缺失的突变株的获得，将为证明本项目所提出的观点提供最充分的实验材料和证据，并能为进一步确定DNA酶的活性位点打下坚实的基础。此外，由于我们发现SP蛋白与灵菌红素的合成有关，因此我们克隆了灵菌红素合成相关酶类的基因，还解析了PigE催化结构域的的结构，灵菌红素和SP蛋白的相关性研究正在进行中。