基于CRISPR文库筛查技术的绒山羊毛囊干细胞增殖必需基因鉴定及功能研究

The recently emerged CRISPR/Cas9 system is becoming a robust tool for genome editing, as well as for genetic screening and functional geneomics, since it could generate gene disruption in a target-specific and high-throughput manner. The hair follicle stem cells (HFSCs) are the basis for the differentiation of other cell types (e.g. outer root sheath, inner root sheath, and matrix) in hair follicles (HFs) and therefore is key to hair regrowth. Based on differently expressed genes generated using skins and HFs in cashmere goats, this project aims to construct a lentivirus transfected sgRNA pooled library for CRISPR screening. The library will be used to infect Cas9 expressed HFSCs which were derived from skin of cashmere goats in vivo. Infected HFSCs at D7 and the uninfected HFSCs will be collected and are subject to whole genome sequencing, to identify genes that are essential for proliferation of HFSCs in cashmere goats. Furthermore, the function of identified essential genes will be validated by gene knockout in HFSCs using laboratory techniques in molecular and cellar levels, as well as using the CRISPR/Cas9 approach to produce transgenic goats with conditional overexpressed essential genes only in their HFs, and further evaluate the phenotypic and genetic differences among edited goats and control animals. This project intends to identify functional genes that are essential to HFSCs, one of the most important cell type for the hair follicle development and regrowth. Our results will benefit the application of molecular breeding in cashmere goats by genome editing, as well as provide valuable insights into HF biology studies in mammals.

CRISPR/Cas9系统可在基因组的特定位点进行编辑，使其成为高通量基因筛选和功能研究的重要工具。毛囊干细胞的增殖过程是毛囊内其它细胞群形成和毛发再生的基础，但参与增殖过程的功能基因尚不明确。本项目以绒山羊皮肤和毛囊差异表达基因为基础，构建聚焦型CRISPR文库。随后，利用该文库侵染体外培养的表达Cas9蛋白的绒山羊毛囊干细胞，于细胞侵染第7天采集侵染组存活细胞和对照组细胞进行全基因组测序。根据测序数据鉴定对毛囊干细胞增殖至关重要的必需基因（Essential genes），并在毛囊干细胞中通过基因敲除试验进行验证。最后，利用CRISPR/Cas9技术制备必需基因在毛囊中特异性过表达的绒山羊，通过表型分析阐明必需基因的作用机制。本项目旨在从大量差异基因中进一步鉴定与毛囊干细胞增殖相关的少数功能基因，为利用基因编辑技术进行绒山羊育种奠定基础，也可为哺乳动物毛囊生物学研究提供参考。

CRISPR筛选技术由于其能以位点特异性和高通量的方式产生基因敲除，使其成为高通量基因功能筛选和功能研究的重要工具，该技术已经在病毒（细菌）宿主基因鉴定及特定细胞必需基因挖掘方面发挥了重要作用。绒山羊因其特色的毛囊结构使其成为毛囊生物学研究的理想模型。目前利用转录组或重测序等技术鉴定了大量与绒山羊绒毛生长和周期性发育相关的候选基因，但仍难以直接鉴定较少数量的关键基因用于后续研究。本研究基于项目组前期拥有的数据和NCBI上公布的数据，构建CRISPR聚焦型文库，通过在与绒山羊绒毛生长和周期性发育密切相关的的毛囊干细胞（HFSC）和毛乳头细胞（DPC）中实现基因敲除来筛选其增殖必需基因。主要结果包括：.（1）选取团队前期所获得的差异基因和NCBI上已公布的初级毛囊和次级毛囊差异基因取并集，共选择822个基因设计并合成5-6个sgRNA，通过慢病毒载体构建和包装获得用于绒山羊皮肤毛囊生物学聚焦型筛选文库。.（2）慢病毒文库分别侵染HFSC和DPC后，对第0、9和15天对细胞基因组进行高通量测序，分别鉴定到400个或82个与HFSC或DPC增殖相关的必需基因；GO分析和KEGG分析表明这些基因中的大多数参与皮肤发育和凋亡过程的负调节、氨基酸的生物合成和MAPK信号通路；选择3个在HFSC和DPC中共同鉴定且未报道的基因（SBDS，HJURP和ALDH1A1），通过小RNA干扰试验，及CCK8、EdU、qPCR等方法验证基因的功能。.（3）选择FGF5基因，利用单碱基编辑器（BE3）通过提前引入终止密码子制备FGF5基因编辑陕北绒山羊，并对其绒毛表型、脱靶突变、生物安全性等进行了系统分析。.此外，本项目还进行相应的拓展性研究，在先导编辑系统出现后，率先利用先导编辑技术创制动物模型，同时针对PE技术编辑效率低的问题，发明了增强型先导编辑系统ePE，使其在细胞中的编辑效率提高了近5倍。.本研究通过构建毛囊特异性文库，首次在山羊中应用CRISPR筛选，并确定了毛囊相关细胞增殖的潜在基因列表。为进一步挖掘和鉴定在绒山羊中具有重要研究和育种价值的关键基因提供了新的研究方法。