硫酸软骨素聚合因子调控Wnt/β-catenin信号通路和斑马鱼胚胎体轴形成作用机理研究

The Wnt/β-catenin signaling pathway plays pivotal roles in embryogenesis of multicellular organisms and adult tissue homeostasis. However，the regulation of β-catenin was not completely clear. Here, we identified Chondroitin Polymerizing Factor (CHPF) played a negative role in Wnt/β-catenin signals. CHPF was a glycosyltransferase which involved in synthesis of the repeating disaccharide region of Chondroitin sulfate chain. The pilot results showed that Chpf regulates body axis formation in zebrafish and promotes the proteasome degradation of active β-catenin by ubiquitin-independent action. To explore the role of Chpf in embryogenesis, we will adapt overexpression, gene knockout, and whole amount in situ hybridization in zebrafish as well as cultured cells to investigate the underlying molecular mechanism of CHPF/Chpf in Wnt/β-catenin signals. The completion of the proposed studies will provide novel insights into the relationship between CHPF/Chpf and Wnt/β-catenin signaling. The anticipated results will lead to understand 1) how Chpf modulates body axis formation in zebrafish embryos and 2) by which mechanism Chpf regulates Wnt/β-catenin signals; 3) the active β-catenin could be modulated by ubiquitin-independent proteasome degradation.

Wnt/β-catenin信号通路是生物体发育调控及稳态维持的重要通路之一。硫酸软骨素聚合因子CHPF是硫酸软骨素糖链合成所需的糖基转移酶。本项目前期新发现CHPF/Chpf能通过非泛素依赖蛋白酶体途径降解活化的β-catenin，从而负调控Wnt通路并调控斑马鱼胚胎体轴形成。本研究拟结合斑马鱼模型和哺乳动物细胞系，详细分析CHPF/Chpf负调控Wnt/β-catenin信号通路的作用机制，阐明CHPF/Chpf调控胚胎体轴发育的生理作用。预期研究结果1)首次解析CHPF重要的生理功能，丰富对糖基转移酶功能的认识；2)鉴定并阐明Wnt/β-catenin信号通路新调控因子及作用方式，促进对Wnt通路调控网络的认识；3)首次发现活化的β-catenin通过非泛素依赖蛋白酶体途径被降解，为Wnt/β-catenin通路的精细调控提供依据和新视角。

体轴建成是脊椎动物胚胎发育过程中最重要的事件之一，需要复杂的信号调控网络实现精细时空调控，其中，Wnt信号通路在前后、左右和背腹体轴发育过程均被报道过其关键作用。但处于胚胎不同组织、不同发育时期，Wnt信号网络被哪些因子调控以及具体调控机制目前并不明确。在本研究中，发现全新体轴调控因子CHPF/Chpf通过下调β-catenin蛋白稳定性抑制Wnt/β-catenin信号通路活性调控斑马鱼左右体轴发育。研究构建了Chpf功能缺失（chpfa-/-;chpfb-/-;chpf2-/-）斑马鱼模型，并揭示Chpf的功能缺失导致斑马鱼心脏、肝胰脏及肠道等不对称发育器官左右分布紊乱。从体节发育初期开始抑制Wnt通路活性可显著营救Chpf功能缺失造成的左右不对称发育紊乱。另外，研究利用斑马鱼和哺乳动物细胞系对CHPF/Chpf调控Wnt/β-catenin信号通路的机制进行解析。研究表明CHPF/Chpf在β-catenin层次调控Wnt通路活性。Wnt激活状态下，过量表达CHPF/CHPF2显著下调非磷酸化β-catenin蛋白水平；敲除CHPF2后，在Wnt本底水平的HEK293T细胞系和Wnt激活水平的SW480细胞系中均检测到β-catenin蛋白水平的增多。进一步研究发现CHPF/CHPF2通过蛋白酶体降解途径进行β-catenin蛋白稳定性调控，这一过程不是依赖经典的泛素识别作用，而是通过CHPF/CHPF2结合β-catenin和蛋白酶体起始亚基RPN10促进β-catenin降解。总之，本研究揭示了一种在斑马鱼体节期发育阶段通过调控Wnt信号通路活性影响左右体轴模式建成的新机制，为体轴发育时空调控模式和Wnt/β-catenin信号调控网络的完善提供了重要支持。