RASSF6-KRAS协同抑制胃癌发生与进展分子机制研究

In our former study, we have screened a novel gastric cancer associated gene, RASSF6, by using multi-plat whole genome screening and bioinformatics analysis. qPCR, immunohistochemistry and western blot verification indicated that RASSF6 expression were significantly decreased in 93.75% gastric cancer tissues. Survival analysis showed that the downregulation of RASSF6 was deeply associated with tumor progression and prognosis of gastric cancer. RASSF6 is a member of RASSFs tumor suppressor gene family, which might integrate with K-RAS to promote apoptosis, inhibit the tumorigenesis, invasion and migration of cancer cell; yet the specific mechanism is still unknown. The present study is to researh the tumor suppressor function of RASSF6 in vivo and in vitro, by using large sample tissue microarray, gene transfection, siRNA and animal assay. Then suppressing K-RAS and/or NF-κB expression by anti-KRAS antibody or NF-kB specific inhibitor PDTC, to detect the impact on RASSF6 protein expression. Subsequently, using co-immunoprecipitation, ChIP, confocal microscopy, dual luciferase reporting assay and western blot to detect whether there is any synergistic reaction between RASSF6 and K-RAS. Thereby, the present research investigate the tumor suppressing mechanism of RASSF6 and might supply novel gene target for gastric cancer therapy, or provide guidance to new anti-tumor drug research and development.

课题组前期通过多平台全基因组扫描及生物信息学分析，筛选出新的胃癌相关基因RASSF6。经qPCR、免疫印迹验证提示93.75%胃癌组织RASSF6表达显著下调；生存分析表明RASSF6下调还与肿瘤进展密切相关。Allen采用基因共转染等研究发现RASSF6直接与K-RAS相互作用，诱导肺癌细胞凋亡、抑制NF-κB通路；Ikeda则发现RASSF6引起Hela细胞凋亡不需与K-RAS结合。由此我们推测：RASSF6可能通过与K-RAS结合并调控NF-κB活性诱导细胞凋亡，抑制胃癌发生及进展。因此，本项目拟采用大样本胃癌组织芯片、基因转染、SiRNA、裸鼠体内成瘤等体内外、正反向调节实验探讨RASSF6抑癌作用；免疫共沉淀、ChIP、共聚焦显微镜、双荧光素酶实验检测RASSF6、K-RAS有无协同作用，阐明其抑癌机制。本研究可为胃癌治疗提供新的基因靶点，指导新的抗肿瘤靶向药物研发。

1. RASSF6在胃癌发生发展过程中的作用：（1）构建大样本胃癌组织芯片，免疫组化检测发现胃癌组织RASSF6蛋白表达较对应正常粘膜显著下调，RASSF6低表达与肿瘤分期、分化密切相关；转移淋巴结组织RASSF6蛋白表达较原发性肿瘤组织更低，RASSF6阴性患者总生存期和无病生存期较RASSF6阳性者明显降低，下调的RASSF6表达是胃癌术后独立预后因素。（2）选择RASSF6低表达细胞株SGC7901，采用慢病毒转染构建RASSF6稳定过表达胃癌细胞株。体外实验表明过表达RASSF6明显抑制SGC7901细胞增殖，减少细胞平板克隆和软琼脂克隆形成数目，降低细胞迁移和侵袭能力；促进SGC7901细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡；体内实验显示RASSF6稳定过表达组裸鼠皮下成瘤的体积及重量均明显小于对照组。2. 生物信息学分析提示miR-181a-5p可作为RASSF6的一个新型调节因素。体内外功能试验提示miR-181a-5p的异常高表达或者沉默表达能分别促进或者抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成、细胞周期转变、侵袭转移和上皮间质转化。miR-181a-5p通过激活RASSF6调节的MAPK信号通路而起致癌miRNA的作用，并可被RASSF6的过表达或沉默表达部分逆转。临床研究发现，miR-181a-5p的高表达预示着胃癌病人的不良预后，特别是合并RASSF6的低表达。提示在胃癌中miR-181a-5p可通过直接抑制RASSF6的表达而起到致癌miRNA的作用。3.（1）RASSF6下游功能基因的表达谱芯片筛选 ：通过Affymetrix 表达谱芯片分析RASSF6 过表达前后差异表达的基因，获得RASSF6下游的功能基因待研列表，通过生物信息学分析获得与RASSF6 相关的细胞信号通路。（2）RASSF6下游功能基因的个性化筛选：在差异表达基因的列表中，初选30个A类基因（新功能基因）在待研细胞中进行qPCR预实验，然后选择20个高表达基因进行RNAi HCS高内涵细胞功能学筛选实验，标记为B基因，作为系统对照实验, 进行HCS 筛选实验和后继实验。（3）下游功能基因的细胞功能学实验：针对HCS筛选所获的RASSF6下游的新功能基因PCDHGA9，并分析其对胃癌细胞功能的影响，发现干扰PCDHGA9基因表达可抑制胃癌细胞的增殖，后续将对这一作用机制进行深入研究。