人降钙素受体胞外结构域与鲑鱼降钙素的相互作用研究

Calcitonin receptor(CTR) belongs to G protein-coupled receptor class B and is related with many human diseases and the peptide ligands salmon calcitonin(sCT) is widely used in clinical treatment. But now the three-dimensional structure of CTR is not reported, the mechanism of molecular recognition of CTR and calcitonin is unclear. The preliminary results show that CTR extracellular domain (ECD)is responsible for ligand recognition and binding. This project is plan to use nuclear magnetic resonance technology to parsing the solution structure of human CTR-ECD and sCT complex, for the purpose of defining interaction sites of CTR-ECD and sCT, the conformational changes of sCT. The CTR and sCT interaction model will be built by combination of point mutation and computational chemistry. A strong complement to the Structure and Function study of the G protein-coupled receptor family will be provided, and a data base for structure-based drug design from CTR and calcitonin both will be offered.

降钙素受体（CTR）属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族B组，与许多重大疾病相关，其多肽配体鲑鱼降钙素(sCT)被广泛应用于临床治疗。但是目前CTR的三维结构尚未报道，CTR与sCT分子识别的机制尚不清楚。前期结果显示CTR胞外结构域(CTR-ECD)主要负责特异性识别并结合sCT。本项目拟利用核磁共振技术，以解析人CTR-ECD与sCT复合物的溶液结构为切入点，明确CTR-ECD与sCT相互作用位点；阐明sCT结合活性与其构象变化之间的关系；结合点突变和理论计算等手段，探索sCT与CTR受体相互作用的机制，尝试建立sCT与CTR分子识别的模型，为GPCR家族结构与功能研究提供有力的补充，并从CTR和降钙素两方面为相关药物设计提供结构基础。

本项目从降钙素CT类药物的临床现状和需求出发，紧密围绕CT与其受体降钙素受体胞外结构域eCTR的相互作用这一核心科学问题，对活性eCTR蛋白的表达纯化、稳定eCTR蛋白样品的制备以及抑制CT聚集的天然产物挖掘开展了深入细致的研究。经系统实验，确定了复性试剂的最优配比，并以此获得了具有显著鲑鱼降钙素sCT结合活性的eCTR蛋白样品； 利用不依赖于连接反应的高效克隆方法（Ligation Independent Cloning，LIC）技术对MBP-eCTR的融合表达条件进行了探索；对eCTR受体及其配体sCT、人降钙素hCT的稳定性及其聚集倾向有了新的系统认识，为后续结构和功能研究指明了方向：解析CTR与其配体CT的相互作用细节需要首先解决CT自身的稳定性问题。由此利用硫磺素T (THT)荧光光谱法发掘了能有效抑制hCT聚集的黄酮类天然产物,其中多羟基取代化合物8的抑制作用最为显著，能够剂量依赖的延后hCT开始聚集的时间并显著降低其聚集倾向。这将为后续eCTR和CT的相互作用研究奠定基础，并有望推动CT类药物更加安全高效的临床应用。