稻瘟病菌过氧化物酶体增殖关键因子PEX11家族的构成及调控机制研究

The appressorium-mediated infection of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae accompany with the rapid degradation and coversion of the spore-stored lipids. As the main organelles of lipid metabolism, peroxisomes proliferate rapidly to adapt the situation during the pre-penetration phase. The genes in PEX11 family are key factors regulating peroxisome proliferation. But to date, the numbers and roles of the PEX11s are obscure in M. oryzae. By sequence similarity, three possible PEX11 members in M .oryzae genome were　detected. Using the gene disruption strategy, we obtained their single-deleted, double-deleted and triple-deleted mutants. The aim of the present project is to clarify which is/are the true membrane(s) of PEX11s in M. oryzae, and explore their roles and functional details in peroxisomal proliferation and fungal infection. We will investigate in this project: 1st, which genes are localized in peroxisomes of M. oryzae by using fluoresent fusion assay; 2nd, which genes are highly expressed during peroxisomal proliferation; 3rd, which genes can restore the Δpex11 mutant of Saccharomyces cerevisiae via cross-complementation; 4th, what roles are executed by these genes in peroxisomal proliferation, peroxisomal metabolism (e.g. lipid metabolism and ROSs degradation), fungal development and host invasion by phenotypic analysis; and 5th, what are their related genes upstream or downstream by using quantitive PCR, BIFC and yeast two-hybrid strategies. The results of this research will be helpful to better understand the PEX11 family and peroxisomal proliferation mechanism in filamentous fungi, and as well provide possible gene targets for new pesticide screening.

稻瘟病菌的侵染依赖孢子贮藏脂肪的迅速转化。作为脂肪代谢的主要场所，过氧化物酶体（P）的产生与增殖对致病性至关重要。项目组曾对稻瘟病菌P产生机制开展研究，而P增殖机制未有报道。PEX11家族是调控P增殖的关键因子，不同物种中该家族构成与功能不同，真菌中尤不明确。通过序列分析，我们发现稻瘟病菌中有3个可能的该家族成员，并分别获得了单、双及三敲除突变体。本项目拟在上述基础上，通过表型分析，结合基因表达、蛋白定位及酵母互补等方法明确这3个基因：1，是否定位于P；2，是否与酵母PEX11同源；3，表达动态是否与P数量及P代谢相关；4，对P增殖、动态、相关生化代谢、病菌形态发育及致病性的作用；5.上下游基因及调控。从而确定稻瘟病菌PEX11家族的构成，并揭示其在P增殖及病菌致病过程中的作用及机制。本研究对稻瘟病菌致病机理与真菌P增殖机制的研究都具有重要意义，并可能为病害防治提供药物靶点。

过氧化物酶体的产生与增殖在稻瘟病菌致病过程中起着重要作用。PEX11家族是调控过氧化物酶体增殖的关键因子，在植物病原菌中研究较少。本项目利用基因敲除结合基因表达分析、基因定位分析、基因互作分析等基因功能分析策略，对稻瘟病菌中过氧化物酶体增殖关键因子PEX11家族的3个可能成员开展研究，从而确定稻瘟病菌PEX11家族的构成，并揭示其在过氧化物酶体增殖及病菌致病过程中的作用及机制。.首先，我们利用基因替换获得了3个目标基因（MoPEX11A、MoPEX11B、MoPEX11C）的单敲、双敲、三敲突变体，恢复转化子以及基因过表达菌株。通过对突变体的全面分析，结合基因表达与调控研究，明确了3个基因在稻瘟病菌过氧化物酶体增殖、生长发育及致病过程中的功能及作用机制。研究结果表明，MoPEX11A与MopPEX11C定位于过氧化物酶体上，而MoPEX11B可能定位于细胞内膜系统。MoPEX11A的敲除导致过氧化物酶体数量变少、体积增大，而MoPEX11B与MoPEX11C的敲除对过氧化物酶体数量无影响，表明MoPEX11A对稻瘟病菌过氧化物酶体增殖至关重要。此外，在伏鲁宁体形成过程中，MoPEX11A基因还影响伏鲁宁体从过氧化物酶体的脱离过程。过氧化物酶体增殖过程的缺陷，导致MoPEX11A突变体中脂肪利用、活性氧降解、细胞壁合成等过氧化物酶体相关代谢发生紊乱，进一步造成病菌在孢子萌发、附着胞形成、寄主细胞侵入等一系列缺陷，最终导致致病性的大幅度降低。同时，MoPEX11A与MoPEX11C的过表达均可导致过氧化物酶体膜的过度延长而无法分裂。这些结果表明，3个基因中，MoPEX11A是调控稻瘟病菌过氧化物酶增殖的关键基因，同时MoPEX11C可能起着辅助作用。在此基础上，我们还在原研究计划的基础上进行了适当深入和拓展。本项目发表相关论文12篇，其中SCI论文（IF>3）6篇。.上述结果是PEX11家族基因在植物病原真菌中的首次研究，对于过氧化物酶体增殖机制和稻瘟病菌致病机理研究都具有重要意义，同时可能为以该基因为靶点的药物筛选和病害防控提供参考。