同时识别多种兽药的重组ScFv抗体的分子作用机制研究

兽药残留已成为影响食品安全的重要因素，开展相关检测技术的基础研究迫在眉睫。多特异性重组单链可变区（ScFv）抗体具有同时与多种不同兽药小分子结合的特点，它的研究是解决同时检测不同类兽药残留免疫分析技术这一问题的一条新途径。本项目拟通过确定磺胺类、喹诺酮类、阿维菌素类等单克隆抗体轻链和重链可变区关键氨基酸位点的基因序列，进行扩增、克隆、测序、表达和鉴定；将获得的针对单类兽药小分子的重组ScFv抗体进一步进行结构解析，引入连接臂基因定向改造，构建表达载体，获得同时识别两类以上兽药的多特异性重组ScFv抗体；建立兽药-抗体的定量构效关系以评价抗体的亲和力和特异性，同时建立兽药-抗体分子互作虚拟模型，分析对接构象，预测其结合位点及相互作用力，并揭示二者结合的分子作用机制，为制备识别多类兽药的广谱性抗体和建立多残留检测技术奠定科学基础。

本项目围绕磺胺类、喹诺酮类等兽医临床上的主要抗菌药物，研究制备相应的广谱性单链抗体，确定了单链抗体重链和轻链基因序列，通过重叠延伸PCR技术将磺胺类和喹诺酮类两个单链抗体的基因拼接，构建了一个双特异抗体基因。通过克隆和转化，构建了双特异抗体基因表达载体，并在大肠杆菌中表达和鉴定。双特异抗体生物活性和亲本单链抗体几乎保持一致。建立兽药-抗体的定量构效关系评价了双特异性抗体的亲和力和特异性，同时建立兽药-抗体分子互作虚拟模型，分析对接构象，预测其结合位点及相互作用力，并揭示二者结合的分子作用机制，为制备识别多类兽药的广谱性抗体和建立多残留检测技术奠定科学基础。.基于上述高性能抗体，本研究分别合成磺胺类荧光标记物和喹诺酮类荧光标记物。利用这两种荧光标记物的激发波长和发射波长不同，建立了一种双标记荧光偏振免疫方法，可同时检测13种磺胺类和19种喹诺酮类药物残留。.在本项目的资助下，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗来识别磺胺类多克隆抗体，以碱性磷酸酶标记羊抗鼠二抗来识别喹诺酮类单克隆抗体，从而实现在同一个反应体系中建立双显色酶联免疫吸附试验方法同时检测牛奶中22种磺胺类和13种喹诺酮类药物残留。