基于微流控芯片和光谱检测的磷酸化蛋白、肽段绝对定量分析新方法

Phosphorylation of protein is one of the most common post-translation modifications of protein (PTMs) that plays important roles to regulate the bio-processes of cells. Biomarkers are indicators of certain biological state or condition, and important for the diagnosis of disease. Protein phosphorylation can affect the biomarkers because of its regulatory effect to the cell signaling process. The quantification of phosphorylated protein and peptides can be significant for the measurement of biomarkers. However, simple, fast, and systematic methods with high-throughput for the absolute quantification of phospho- proteins and peptides have not yet been developed. Due to their characteristics of low-cost of fabrication, mass production, small consumption of reagents, capability of multiple-functionalization et al, microfluidic devices or microfluidics based platforms on the other hand have been applied in various fields such as environmental analysis, bio-analysis, and medical diagnosis. UV/vis spectrophotometry is a very facile technique, and can support the absolute quantification of substrate solution based on the Beer-Lambert law. Though, unsatisfactory sensitivity may limit the development of UV/vis spectrophotometry for the analysis of phosphorylated peptides that usually has very low abundance in bio-samples. The present proposal not only proposes on how to enrich and concentrate the phosphorylated peptides and improve their detection sensitivity, but also on how to quantify the phospho-peptides from samples with interferences by virtue of recognition probes. Protein kinase and phosphatase will be taken as examples to demonstrate that the developed strategy can be applied to study their activity and inhibition by drugs. Biosamples such as fluids or cells will be taken to study the abnormality of phosphorylated proteins in biomarkers. This study is promising to favor the early diagnosis of human diseases.

磷酸化蛋白的表达差异是生物标志物的一个重要方面，磷酸化肽段的定量研究对于寻找疾病生物标志物具有重要的意义，但是，对于磷酸化肽段的高通量、系统化的检测识别和定量检测方法仍然有待于进一步开发。微流控器件的特点，如相对低廉的制造成本、小体积、批量生产、易实现多功能整合，使得微流控平台在环境分析、生物分析、疾病检测等众多领域中具有很大的应用潜力。光谱技术尤其是紫外/可见光谱技术，方法简单，可实现对底物的绝对定量。本计划基于微流控芯片和光谱技术对磷酸化肽段绝对定量研究提出新方法，就如何分离和浓缩低丰度磷酸化肽段以提高检测灵敏度，以及如何借助探针识别磷酸化蛋白、肽段但同时排除样品中干扰物的影响提出具体方案。在实际应用方面，拟利用所开发的技术方法对细胞等生物样品进行研究，从而对与磷酸化蛋白、肽段相关的生物标志物浓度的异常做出早期预判，助力人类疾病早期检测。

蛋白质磷酸化是蛋白质的翻译后修饰，在生物调控中起着重要的作用。在食品研究中，发现磷酸化蛋白质的变化是动物肌肉食品质量变化的关键要素之一。.已有研究利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹技术来测量调控蛋白磷酸化的变化，但SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹方法需要大量原始样品才能达到可测量的蛋白质水平，而且蛋白质提取程序可能导致功能化蛋白的损失。基于质谱（MS）技术开发了固定化金属亲和色谱（IMAC）、化学标记技术、质谱图和前体离子扫描方法，通过对肽段测序定位磷酸化位点以及对磷酸化蛋白进行定量分析。然而，基于MS的方法大多涉及相对昂贵的试剂和仪器，通常需要专人。 .本项目研究中，首先，基于铁离子（Fe3+）和紫外-可见光谱法开发了一种量化磷酸化蛋白质和/或肽的新方法，在Fe3+的辅助下，该方法可以有效区分磷酸化和非磷酸化肽段。通过分析不同磷酸化位点的多肽的混合溶液，验证了该方法可以通过检测光吸收信号的增强，关联磷酸化肽段的浓度。使用0.1%TFA水溶液可从动物肌肉样品中提取蛋白，基于Fe3+和紫外-可见光谱可成功表征和定量样品中的磷酸化蛋白的量。将具有一个磷酸化位点的肽作为参考标准，成功地实现了冷冻储存期间动物源性食品肌肉食物样品中磷酸化蛋白的绝对定量；其次，本项目开发了微柱填充的微流控芯片，基于三氧化二铝溶胶凝胶对芯片表面进行功能化之后，可对复杂背景生物样品中的磷酸化蛋白和/或肽段进行有效捕获，质谱检测结果显示该表面对磷酸化蛋白/肽段进行特异性捕获，结合Fe3+和紫外-可见光谱检测，可对捕获到的样品进行定量分析。所开发的检测方案具有简便、易操作、造价低、可实现对底物的绝对定量等优点。.该项目研究为评估食品样品中的蛋白质磷酸化和磷酸化蛋白质定量水平开辟了一条新途径，有望用于生物样品中与磷酸化蛋白、肽段相关的生物标志物浓度进行绝对定量。