Mesd／LRP1调控ERK信号通路在视网膜新生血管中的作用及机制研究

Retinal neovascularization can lead to irreversible blindness. Through the Open reading frame phage display and Next Generation Sequencing (OPD-NGS) screening system, We found that mesoderm development (Mesd) was up-regulated in the retina of diabetic retinopathy (DR) mouse. It maybe an angiogenesis ligand. Mesd is an endoplasmic reticulum chaperon for low-density lipoprotein receptor-related proteins (LRPs). Our prievous study showed that RNV area decreased after intravitreous injection of anti-Mesd. In human retinal microvascular endothelial cells(HRMECs), phosphorylated lipoprotein receptor related protein 1(LRP1) was up-regulated and positive correlated with Mesd. It suggested that LRP1 was also involved in the pathogenesis of RNV..Thus, this project aim to use the human retinal microvascular endothelial cells in vitro, by means of gene silencing and over expression, to understand the role of Mesd and LRP1 in the pathogenesis of RNV. In vivo study, high oxygen induced OIR model will be used, and we will use a variety of molecular biology methods to explore the mechanism of Mesd/LRP1 in pathogenic role of RNV. The results of this project will provide strong evidences for the theory and practical application for the development of new drugs on blindness caused by RNV.

视网膜新生血管是很多致盲性眼病视力丧失的主要原因。我们前期研究通过噬菌体展示和二代基因测序筛选技术发现DR鼠视网膜中胚层分化蛋白(Mesd)表达显著上调,可能是一个促血管生成的配体，玻璃体腔注射anti-Mesd可显著减少RNV面积，Mesd介导低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRPs）家族成员各种不同的生物学功能，包括内吞、转运及信号转导功能，体外过表达Mesd可促进人视网膜微血管内皮细胞LRP1磷酸化，因此推测Mesd/LRP1以配体受体的结合方式参与了视网膜新生血管的调控。本项目拟以氧诱导OIR动物模型及人视网膜微血管内皮细胞为模型，通过基因沉默、过表达技术及分子生物学手段，全面探索Mesd/LRP1在视网膜新生血管中的作用，挖掘其促血管作用的下游靶基因及相关信号通路，探讨干预Mesd/LRP1信号轴抑制视网膜新生血管的可能性，将有助于揭示视网膜新生血管形成的新机制。

视网膜新生血管是很多致盲性眼病视力丧失的主要原因。目前临床上广使用的抗VEGF制剂面临一些问题：部分患者对治疗不敏感、频繁给药、药效不持久等。我们前期研究通过噬菌体展示等技术发现DR鼠视网膜中胚层分化蛋白(Mesd)表达显著上调, 是一个促血管生成的配体，Mesd是低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）家族的分子伴侣，体外过表达Mesd可促进人视网膜微血管内皮细胞LRP1磷酸化。因此我们着重探讨了Mesd/LRP1以配体受体的结合方式参与了视网膜新生血管的调控及其分子机制。.研究方法:采用人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)，通过Mesd、LRP1和AP-1质粒或小干扰RNA改变其表达，观察三者之间的调控作用；通过定量PCR、蛋白免疫印迹法检测Mesd、LRP1和内皮细胞标记蛋白表达，通过划痕实验、成管实验及CCK-8等实验观察HRMEC的形态变化。通过构建OIR小鼠模型，采用玻璃体腔注射、视网膜铺片和免疫荧光染色等方法，观察Mesd/LRP1信号轴对小鼠视网膜新生血管生成的作用，通过定量PCR、蛋白免疫印迹法检测ERK信号通路及靶基因AP-1和S100A8/9的表达变化。 .研究结果：体外研究证实Mesd过表达能促进HRMEC增殖、迁移及成管。在缺氧细胞模型中，通过Mesd及LRP1 siRNA转染后，HRMEC增殖、迁移及成管显著减少。通过转染Mesd和AP-1质粒后，双荧光素酶报告基因证实二者转录活性和蛋白表达水平均显著上调，siMesd和siAP-1转染后，二者蛋白表达水平均显著下降，证实Mesd和AP-1的相互调控作用。体内研究证实:OIR模型P12时玻璃体腔注射antiMesd抗体后RNV荧光染色面积较IgG组和PBS组均显著减少。PCR和Westernblot证实抑制Mesd和LRP1后视网膜组织中VEFGF表达降低。通过缺氧细胞模型的不同分组，Westernblot显示Mesd过表达促进ERK磷酸化及AP-1和S100A8/9的表达增加，回复实验验证敲低LRP1可逆转ERK磷酸化。.研究结论及科学意义: Mesd有显著的促新生血管活性，Mesd/LRP1信号轴通过ERK信号通路调控视网膜新生血管生成并通过其下游靶基因AP-1、S100A8/9发挥作用，干预Mesd/LRP1信号轴可抑制视网膜新生血管生成，为靶向治疗视网膜新生血管打下坚实的理论基础。