基于DNA-稳定同位素探针的纤维素分解菌群的宏基因组学研究

Straw biorefinery can effectively relieve energy crisis. However, the low activity of cellulase is the major neckbottle which limits the industrialization of straw biorefinery. Metagenomic technology provides a new way for discovering high-activity cellulases, but it has the limitation of low sceening efficiency. In this project, it is attempted to combine DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) and metagenomics for improving the hit rate of discovering novel cellulases. The main contents are described as follows: first, producing high-quality 13C-cellulose by active microbes, and which is then used as the substrate for the microbes enrichment in environmental samples; Meanwhile, analyzing the diversities of microbial community and functional genes for cellulose degradation by molecular fingerprint technologies. Then, screening novel cellulases from 13C-metagenomic DNA using different strategies, and realizing the heterologous expression of metagenome-derived cellulases. This study will provide effective enzyme catalysts for cellulose biorefinery and accelerate the development of straw utilization.

秸秆生物炼制可有效地缓解能源危机，而纤维素酶的低催化活性限制了其工业化应用。宏基因组学技术的发展为高活性纤维素酶的开发提供了新思路，却普遍存在筛选效率低下的局限。针对这一问题，本项目拟将DNA-稳定同位素探针技术(DNA-SIP)引入到传统的宏基因组学中，以提高新型纤维素酶的发现概率。采用微生物合成高质量的13C-纤维素，并作为标记底物对环境样品进行功能微生物的富集；同时应用分子指纹技术鉴定参与13C-纤维素分解的微生物菌群及功能基因多样性，揭示其生理代谢机制；在此基础上，结合不同筛选策略获取13C-宏基因组DNA中的新型纤维素酶，并对其实现高效异源表达。本研究旨在为纤维素生物炼制提供高效的纤维素酶催化剂，进而加速秸秆资源化的工业化进程。

秸秆生物炼制可有效地缓解能源危机，而纤维素酶的低催化活性限制了其工业化应用。宏基因组学技术的发展为高活性纤维素酶的开发提供了新思路，却普遍存在筛选效率低下的局限。针对这一问题，本项目拟将DNA-稳定同位素探针技术(DNA-SIP)引入到传统的宏基因组学中，以提高新型纤维素酶的发现概率。具体研究内容包括：13C-纤维素的微生物合成；纤维素厌氧降解体系的构建及驯化；13C-宏基因组DNA的制备；纤维素厌氧分解菌及乙酸氧化菌的DNA-SIP分析；以及对RNA-SIP技术的探索。研究结果显示：木醋杆菌在好氧条件下能以13C-葡萄糖为底物成功地合成颗粒状的13C-细菌纤维素；同时构建纤维素厌氧干式及湿式甲烷发酵体系，经过长时间的驯化反应器运行稳定，可为后续DNA-SIP分析提供有效的原材料；CTAB法为最佳的宏基因组提取方法，适合于含多糖较多的纤维素体系的DNA提取；最佳密度梯度离心条件为1.95 g/L CsCl母液，177,000 g离心40 h，该条件可有效分离12C-DNA及13C-DNA，且13C-DNA主要被富集在1.75 g/L左右的密度层；经过15 d的13C-乙酸富集，乙酸氧化菌被成功标记，群落分析显示它们主要为未培养的Proteobacteria，该体系中氢营养产甲烷古菌的存在证实了这些细菌确实具有乙酸氧化功能，而经12C-乙酸富集到的优势乙酸氧化菌则属于Firmicutes，该结果证实了DNA-SIP在鉴定功能微生物方面的可行性；经过21 d的13C-细菌纤维素富集，纤维素降解菌被成功标记，可用于后续的群落分析及纤维素酶筛选研究；探索了RNA-SIP鉴定乙酸氧化菌的可行性，初步结果显示RNA-SIP在缩短标记时间及避免底物二次利用方面比DNA-SIP具有优势，更适合于纤维素类大分子物质的功能菌株鉴定。以上结果证明基于DNA或RNA的稳定同位素探针技术具有为秸秆的生物炼制提供生物催化剂资源的巨大潜力。